蛇床子素通过c-met/PI3K/AKT途径提高顺铂对肺癌细胞的杀伤活性

叶海南

蛇床子素通过c-met/PI3K/AKT途径提高顺铂对肺癌细胞的杀伤活性

叶海南

目的 探讨蛇床子素是否能提高顺铂对肺癌细胞的杀伤活性并研究其机制。方法 A549非小细胞肺癌细胞按对照组、蛇床子素组、顺铂组、蛇床子素+顺铂组及蛇床子素+顺铂+c-met质粒组进行分组后，MTT法检测A549细胞活力，Western blot实验检测A549细胞蛋白酪氨酸激酶（cmet）表达水平，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）磷酸化水平及半胱天冬酶（caspases）活化水平的影响，流式细胞术检测A549细胞的凋亡。结果 顺铂+蛇床子素组A549的细胞活力抑制率[（59.8±3.5）%]显著高于顺铂单治疗组[（16.9±1.2）%，P＜0.05]和蛇床子素+顺铂+c-met质粒组[（21.6±1.5）%，P＜0.05]。蛇床子素处理可诱导A549细胞c-met蛋白的下调并抑制A549细胞PI3K和AKT的磷酸化。顺铂+蛇床子素组对A549细胞的凋亡诱导率[（29.7±2.1）%]显著高于顺铂组[（7.8±0.9）%，P＜0.05]和蛇床子素+顺铂+c-met质粒组[（10.1±1.5）%，P＜0.05]。顺铂+蛇床子素组A549细胞的Caspase-9、Caspase-3活化水平显著高于顺铂组和蛇床子素+顺铂+c-met质粒组。结论 蛇床子素通过下调c-met表达提高肺癌细胞对顺铂的敏感性。

A549非小细胞肺癌细胞；蛇床子素；c-met；PI3K/AKT；顺铂

顺铂属于广谱抗肿瘤药物，对多种肿瘤细胞均有很好的杀伤活性。在顺铂的临床应用中，肺癌细胞对顺铂最为敏感，因此顺铂现已作为一线药物广泛应用于非小细胞肺癌的治疗[1]。然而随着顺铂的持续使用，肺癌细胞对顺铂的敏感性会逐渐降低[2]。因此通过辅助治疗药物提高肺癌细胞对顺铂的敏感性是提高其疗效的有效方法。本研究的目的在于探讨蛇床子素是否能提高顺铂对肺癌细胞的杀伤活性并研究其机制。

1 材料与方法

1.1 试 剂 顺铂、蛇床子素、噻唑蓝（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）和凋亡检测试剂盒购于美国Sigma-Aldrich。改良杜氏伊格尔培养基（DMEM）购于美国Gibco。蛋白酪氨酸激酶（c-met）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）、活化半胱天冬酶-9（caspase-9）、活化半胱天冬酶-3（caspase-3）、β-肌动蛋白（β-actin）、兔抗人抗体购于美国Cell Signaling。增强化学发光（ECL）试剂盒购于美国 Pierce。pcDNA3.1和脂质体 2000（Lipofectamine2000）购于美国Invitrogen。

1.2 细胞培养 本研究于2014年10月—2016年11月完成于本院实验室。人非小细胞肺癌细胞系A549购于美国模式菌种收集中心（ATCC）。细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养环境为37°C恒温培养箱中培养并通入5%CO2。细胞每2～3天传代一次，传代时，用胰酶消化液使细胞进入悬浮状态并用DMEM培养基洗涤两次，将细胞悬液按1:3稀释后传代。

1.3 c-met重组质粒构建和转染 将c-met基因cDNA全长序列（Gene ID：NM_001324401）以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成c-met重组真核表达质粒[3]。使用Lipofectamine2000按照试剂操作说明书步骤将2μg/mL c-met质粒转染入A549细胞中。

1.4 细胞活力抑制率测定 实验分为对照组、蛇床子素组、顺铂组、蛇床子素+顺铂组及蛇床子素+顺铂+c-met质粒组，分组培养方法见表1，药物处理时间为48h（药物处理48h即能发挥抗肿瘤效应）。药物处理完毕后加入 20μL MTT（5mg/mL）37°C 恒温培养箱中培养4h，移除孔内培养基，加入100μL二甲亚砜，570nm波长下测定OD值。细胞活力抑制率用以下公式计算：抑制率=（OD对照组-OD药物处理组）/OD对照组×100%。

表1 A549细胞实验分组方法

1.5 Western blot实验 将A549细胞按上述进行分组。药物处理完毕后用蛋白提取液提取A549细胞中的总蛋白质。将等量的总蛋白质用12%SDS-PAGE进行电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上，用c-met、磷酸化PI3K、磷酸化AKT、活化 Caspase-9、活化Caspase-3和β-actin兔抗人抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

1.6 细胞凋亡实验 将A549细胞按上述进行分组。药物处理完毕后按照凋亡试剂盒说明书步骤将PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入细胞中孵育20min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，Annexin-V阳性细胞即为凋亡细胞。

2 结果

2.1 蛇床子素对顺铂有协同抗肺癌作用 顺铂和蛇床子素单独治疗对A549细胞的杀伤活性较弱，两者联合后能显著诱导A549细胞发生死亡（见表2）。Western blot实验结果显示，蛇床子素处理能显著下调A549细胞c-met蛋白的表达水平，而顺铂处理对c-met无影响（见插页图1）。同时，在A549中转染c-met质粒强制表达c-met蛋白后，蛇床子素对顺铂的协同抗肿瘤效应受到明显抑制（见表2）。

表2 各组细胞活力比较（%，±s）

表2 各组细胞活力比较（%，±s）

注：蛇床子素浓度均为10μmonl/L，顺铂浓度均为 2μmol/L，c-met质粒浓度为2μg/mL；与顺铂组比较，#P＜0.05，与蛇床子素组比较，amp;P＜0.05，与顺铂+蛇床子素组比较，□P＜0.05；c-met：蛋白酪氨酸激酶

组别对照组顺铂组蛇床子素组顺铂+蛇床子素组顺铂+蛇床子素+c-met质粒组孔数3 3 3 3 3细胞活力抑制率0 16.9±1.2 8.7±0.7 59.8±3.5#amp;21.6±1.5□

2.2 各组PI3K/AKT表达水平比较 Western blot实验结果显示蛇床子素能显著抑制A549细胞PI3K和AKT的磷酸化。当转染c-met表达质粒后，顺铂联合蛇床子素对PI3K/AKT途径的抑制作用显著降低，表明蛇床子素通过下调c-met蛋白的表达增强顺铂对PI3K/AKT途径的抑制作用（见插页图2）。

2.3 各组A549细胞Caspases的活化和凋亡率比较流式细胞实验结果显示蛇床子素能显著提高顺铂对A549细胞的凋亡诱导率，而转染c-met质粒能显著抑制两者联合对A549细胞的凋亡诱导效应（见表3，插页图3）。蛇床子素能显著促进顺铂对A549细胞caspase-9和caspase-3的活化（见插页图4）。

表3 各组A549细胞凋亡诱导率比较（%，±s）

表3 各组A549细胞凋亡诱导率比较（%，±s）

注：蛇床子素浓度均为 10μmonl/L，顺铂浓度均为2μmol/L，c-met质粒浓度为2μg/ml；与顺铂组比较，#P＜0.05，与蛇床子素组比较，amp;P＜0.05，与顺铂+蛇床子素组比较，□P＜0.05；c-met：蛋白酪氨酸激酶

组别对照组顺铂组蛇床子素组顺铂+蛇床子素组顺铂+蛇床子素+c-met质粒组孔数3 3 3 3 3凋亡诱导率2.2±0.4 7.8±0.9 6.1±0.8 29.7±2.1#amp;10.1±1.5□

3 讨论

非小细胞肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[4]。在肺癌的治疗中，以顺铂为代表的化疗是不可替代的常规治疗方法，但肿瘤细胞对化疗逐渐产生的耐药性却大大限制了其疗效[5]。

蛇床子素是从天然植物蛇床子中提取的活性物质，近年研究发现蛇床子素还具有良好的抗肿瘤作用，对多种恶性肿瘤均有良好的辅助治疗作用[6-7]。在本研究中，笔者发现蛇床子素能显著增强非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性，使较低剂量的顺铂亦能发挥强大的杀伤肿瘤细胞的生物活性的作用，证明蛇床子素与顺铂存在协同抗肺癌活性。

文献[8-9]报道，肿瘤细胞中PI3K/AKT通路的持续活化能通过激活下游分子促进细胞的增殖和存活，同时抑制凋亡的发生，然而肿瘤细胞中的PI3K和AKT往往磷酸化程度很高，因此抑制PI3K/AKT通路是提高抗肿瘤药物疗效的重要策略。研究[10-11]发现，肿瘤细胞PI3K/AKT通路受肝细胞生长因子受体c-met的调节，高表达的c-met能激活肿瘤细胞中包括PI3K/AKT在内的多种促进肿瘤存活和生长的信号通路。因此c-met途径是诱导肺癌细胞产生对顺铂获得性耐药的重要机制，过表达的c-met能显著激活PI3K/AKT通路减弱抗肿瘤药物的凋亡诱导活性[12]。本研究结果显示蛇床子素对肺癌细胞进行处理后，细胞c-met的表达水平显著降低，使c-met/PI3K/AKT通路受到抑制。当用蛇床子素和顺铂对肺癌细胞进行联合治疗时，由于肿瘤细胞的PI3K/AKT受到显著抑制，因此顺铂能显著诱导肺癌细胞发生caspases的活化和凋亡的发生。

综上所述，蛇床子素能显著提高非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性，增强顺铂的抗肿瘤活性。

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Osthole Enhances Cisplatin-induced Cell Death in Lung Cancer Through c-met/PI3K/AKT Pathway

YE Hainan.
Clinical Laboratory,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310000),China

Objective To investigate the effect of osthole on enhancing the cytotoxicity of cisplatin to lung cancer and the underlying mechanism.Methods A549 lung cancer cells were divided into control group,osthole group,cisplatin group,osthole+cisplatin group and osthole+cisplatin+c-met plasmid group.MTT assay was performed to evaluate the viability of A549 cells in each group.Western blot analysis was performed to detect the expression of c-met,phosphorylation of PI3K and AKT and activation of caspases in A549 cells in each group.Flow cytometry analysis was performed to measure the apoptotic rate of A549 cells in each group.Results Cell viability inhibitory rate of A549 cells in cisplatin+osthole group （59.8±3.5）%was significantly higher than cisplatin group[（16.9±1.25）%,P＜0.05]and cisplatin+osthole+c-met plasmid group[（21.6±1.5）%,P＜0.05].Treatment with osthole significantly inhibited the expression of c-met as well as enhancing the inhibition of PI3K and AKT phosphorylation.Cell apoptotic rate of A549 cells in cisplatin+osthole group（29.7±2.1）%was significantly higher than that in cisplatin group[（7.8±0.9）%,P＜0.05]and cisplatin+osthole+c-met plasmid group[（10.1±1.5）%,P＜0.05].Activation of caspase-9 and caspase-3 in cisplatin+osthole group was more remarkable than that in cisplatin group and cisplatin+osthole+c-met plasmid group.Conclusion Osthole enhances cisplatin-induced cell death in lung cancer through c-met/PI3K/AKT pathway.

A549 non small cell lung cancer;osthole;c-met;PI3K/AKT;cisplatin

浙江省立同德医院检验科（杭州 310012）

（收稿：2017-02-20 修回：2017-05-30）