球孢白僵菌tps1转基因菌株与初始菌株生物学特性比较

谢翎

摘 要：该文对SDAY培养基上培养的球孢白僵菌tps1转基因工程菌株与原始出发菌株各自在菌落形态，菌丝生长速度，产孢量等方面进行了综合评价。结果表明：球孢白僵菌tps1转基因工程菌株与原始出发菌株的菌落形态有一定差异。且球孢白僵菌tps1转基因菌株菌丝生长速度更快，其菌丝生长速度为（3.73±0.05）㎜/d而原发菌株菌丝生长速度为（3.45±0.52）㎜/d。另外，重组菌株的产孢量（0.92±0.02）×108个，明显低于原始出发菌株（1.12±0.17）×108个。

关键词：球孢白僵菌；生物学特性；转基因

中图分类号 Q936 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）22-0034-02

Abstract：The biological characteristics of Beauveria bassiana tps1 recombination strain and its origin strain were evaluated based on colonial form， rate of colony growth and spore-bearing yield. The results showed that the colonial forms of these two strains are similar. Moreover， the recombination strain （3.73±0.05 ㎜/d） grow faster than the origin strain（3.45±0.52㎜/d）. And the spore-bearing yield of the recombination strains was （0.92±0.02）×108 ，while the spore-bearing yield of the origin strain was（1.12±0.17）×108.

Key words：Beauveria bassiana；Biological characteristics；Transgene

1 引言

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是国内外广泛用于害虫生物防治的杀虫真菌之一，被认为是最具开发潜力的一种昆虫病原真菌。通过基因改造其环境适应性，是进一步扩大球孢白僵菌杀虫剂应用的有效手段。我们前期工作中利用含有构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子的质粒pBARGPE1对球孢白僵菌Bb202菌株的海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1进行了组成型超量表达。在此基础上，本研究对tps1转基因重组菌株与其原始出发菌株在生物学特性以及产孢率进行了检测。

2 材料与方法

2.1 菌株来源 供试的白僵菌Bb202菌株由本实验室保存，其寄主为松褐天牛，采自日本。球孢白僵菌tps1基因，组成型表达重组菌株，由本实验室前期构建。

2.2 培养基 SADY固体培养基：葡萄糖4%、酵母浸出粉1%、蛋白胨1%、琼脂2%。高压灭菌锅中灭菌后备用。SDY液体培养基：葡萄糖4%、酵母浸出粉1%、蛋白胨1%。高压灭菌锅中灭菌后备用。

2.3 实验方法

2.3.1 菌落形态的观察 将保存的球孢白僵菌原发菌株和球孢白僵菌tps1转基因工程菌株分别配成1×106孢子/mL浓度的孢悬液，并用微量移液器取3μL点于萨氏培养基SDAY培养基平板正中心，25℃恒温培养并观察菌落形态特征。

2.3.2 菌落生长速度测定 按前述方法将球孢白僵菌原发菌株和球孢白僵菌tps1转基因菌株分别接种在SDAY斜平板上，置于25℃恒温培养。每48h，定时用精密卡尺检测菌落直径并记录、分析比较各菌株的菌落生长速度，共记录10d。

2.3.3 产孢量测定 将上述方法培养12d的样本用于产孢量的测定。即在菌株培养到第12天的平板上，用直径为5㎜的打孔器在菌落中央到边缘的中点处取出一定面积的菌落块，放入试管中，再加入适量的吐温-80和无菌水，加上棉塞，置于摇床上摇一夜，使分生孢子充分摇散，制成孢子悬液。然后用胶头滴管取一滴混匀的孢子悬液，滴加到血细胞计数板上，在显微镜下进行计数，测定孢子量。每种菌株重复3次，统计每种菌株的产孢量，比较球孢白僵菌原发菌株与球孢白僵菌tps1转基因菌株在SDAY平板培养基上的产孢量。计算公式如下：

1㎝2菌落含孢量=（平均每小格孢子数×4×106×稀释倍数）/打孔面积

3 结果与分析

3.1 菌落形态比较 在SDAY培养基上，分别对球孢白僵菌原发菌株和球孢白僵菌tps1转基因工程菌株进行培养一段时间，结果发现2种菌株的菌落外观初期菌落形态及色泽无差异，但产孢后孢子色泽不同。生长后期，菌落表面凹凸形态及放射沟也有差别（表1、图1）。

3.2 菌落生长速度比较 由表2可知，2种菌株在SDAY培养基上营养生长量存在差异。10d内菌落平均生长直径在34.5～37.3mm。从总体上来看，球孢白僵菌tps1转基因工程菌株的菌落生长速度较快，其菌落平均生长速度达（3.73±0.05）mm/d，而原发菌株的菌落平均生长速度为（3.45±0.52）mm/d。分析同时表明在生长初期，转基因菌株的菌落生长速度较快，而到生长后期，2种菌株的菌落生长速度差别不大。

4 讨论

TPS在海藻糖合成的第一步中起作用，催化UDP葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸形成海藻糖-6-磷酸。将tps1基因导入球孢白僵菌中能使它积累海藻糖，海藻糖不仅是一种可存储的糖类物质，而且是一种重要的胁迫保护剂，因此可以提高球孢白僵菌在胁迫环境中的抗逆性。

为评价球孢白僵菌tps1转基因工程菌株生物学特性，本文通过菌落形态、菌落生长速度（营养生长量）、产孢量等指标，以反映转基因后菌株性状变化。前期研究表明，球孢白僵菌tps1转基因工程菌株在胁迫环境中，抗逆性明显增强。而在产孢量与菌落生长速度的变化，也会对球孢白僵菌的生产应用造成影响。

本研究发现，tps1转基因工程菌株的菌落生长速度略快于初始菌株，但其产孢量明显下降。这表明tps1的基因改造加快了菌体的营养生长（菌丝生长），但其生殖生长（产孢）却受到了一定抑制。

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（责编：张宏民）endprint