姜黄素通过调控JAK2/STAT3信号通路对高糖环境下心肌细胞生物学特性的影响

邓士兵 夏 豪 周忠泉

(武汉大学人民医院心内科，湖北 武汉 430060)

姜黄素通过调控JAK2/STAT3信号通路对高糖环境下心肌细胞生物学特性的影响

邓士兵 夏 豪 周忠泉

(武汉大学人民医院心内科，湖北 武汉 430060)

目的探讨姜黄素对高糖环境下的心肌细胞生物学特性影响。方法以心肌细胞HCM为研究对象，分别用高糖和低糖细胞生长液培养心肌细胞，同时在细胞生长液中加入姜黄素。MTT检测作用24 h、48 h、72 h的细胞增殖情况。流式细胞仪检测48 h的心肌细胞凋亡情况。DCFH-DA探针检测心肌细胞内活性氧水平。Western印迹检测相关蛋白表达水平。结果高糖组心肌细胞增殖与对照组相比明显受到抑制(Plt;0.01)。实验组中心肌细胞增殖情况明显高于高糖组(Plt;0.01)。高糖组心肌细胞凋亡率明显高于对照组(Plt;0.01)；实验组心肌细胞凋亡率明显低于高糖组(Plt;0.01)。高糖组心肌细胞中Bcl-2的表达水平明显低于对照组(Plt;0.01)；高糖组心肌细胞中Bax的表达水平明显高于对照组(Plt;0.01)；实验组心肌细胞中Bcl-2的表达水平明显高于高糖组(Plt;0.01)；实验组心肌细胞中Bax的表达水平明显低于高糖组(Plt;0.01)。高糖组心肌细胞中荧光强度明显高于对照组(Plt;0.01)；实验组心肌细胞中荧光强度明显低于高糖组(Plt;0.01)。对照组、高糖组和实验组心肌细胞中JAK2、STAT3表达水平没有明显变化。高糖组心肌细胞中p-JAK2、p-STAT3表达水平显著低于对照组(Plt;0.01)。实验组心肌细胞中p-JAK2、p-STAT3表达水平明显高于高糖组(Plt;0.01)。结论高糖对心肌细胞增殖具有抑制作用，对细胞凋亡具有促进作用。姜黄素可以通过作用于JAK2/STAT3信号通路改善高糖环境下的心肌细胞损伤。

心肌细胞；姜黄素；增殖；活性氧

糖尿病性心肌病变是一种发生于糖尿病患者的特殊的心肌性疾病，主要表现为心室舒张功能异常〔1〕。心肌细胞在糖尿病性心肌病变中发挥重要作用〔2〕。糖尿病大鼠模型中，心肌细胞出现明显的凋亡现象〔3〕。心肌细胞的凋亡与心肌肥厚、心力衰竭、动脉粥样硬化等多种心血管疾病有关〔4〕。姜黄素(Curcumin)提取自姜科植物，可以降低小鼠心肌纤维化的程度，对心脏具有一定的保护作用。姜黄素除了具有保护心脏大血管的作用外，对心肌细胞损伤也具有一定的保护作用〔5〕。姜黄素可以通过调控相关的蛋白激酶活性作用于心肌细胞〔6〕。本研究探讨姜黄素对心肌细胞的作用机制，以期为治疗糖尿病心肌病奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 人心肌细胞(HCM)购自中国医学科学院。

1.1.2主要仪器及试剂 姜黄素购自成都瑞芬思生物科技有限公司；胰蛋白酶、青链霉素、DMEM-F12、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒均购自美国Simga；p-JAK2单克隆抗体、JAK2单克隆抗体、p-STAT3单克隆抗体、STAT3单克隆抗体、Bcl-2单克隆抗体、Bax单克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体购自美国Cell Signaling；CO2培养箱、流式细胞仪均购自美国Thermo。

1.2方法

1.2.1细胞培养 保存于液氮管中的心肌细胞HCM放在37℃的孵育器中融化，加入含有胎牛血清浓度为10%的DMEM-F12细胞生长液，充分混合后，转移到离心管中，1 000 r/min离心10 min后，弃掉上清液，用细胞生长液悬浮细胞，种植于细胞培养瓶中，培养条件是37℃，5% CO2培养箱。观察细胞浓度为90%时，倒掉细胞生长液，加入0.125%胰蛋白酶消化细胞后，离心，用细胞生长液悬浮细胞，转移到细胞培养瓶中继续培养。

1.2.2噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖 将培养至对数生长期的心肌细胞分为三组，分别为对照组、高糖组、实验组。对照组中心肌细胞培养液用正常的含有D-葡萄糖浓度为5.5 mmol/L的细胞生长液，高糖组和实验组心肌细胞用含有D-葡萄糖浓度为30 mmol/L的细胞生长液。实验组中加入姜黄素使其终浓度为0.5 μg/ml。同时设置空白组，空白组不加入细胞，加入等量的细胞生长液。将各组细胞接种到96孔细胞培养板中，每毫升细胞生长液中含有细胞个数为1×105个。培养细胞48 h后，在细胞中加入MTT溶液20 μl。放在37℃孵育反应4 h。倒掉上清液，加入100 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液，酶标仪检测每孔中的吸光度。计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组-空白组)/(对照组-空白组)。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡 取培养48 h的各组心肌细胞，加入0.125%胰蛋白酶消化后，1 000 r/min离心10 min，在细胞中加入磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮细胞，离心后，弃上清液。加入适量的PBS使细胞浓度为1×105个/ml。混合均匀后，取1 ml细胞悬浮液，收集细胞，加入PI和Annexin V各5 μl，充分混合，放在室温环境下孵育反应15 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.4DCFH-DA探针检测活性氧水平 取培养48 h的心肌细胞，经0.125%胰蛋白酶消化后，将细胞接种于六孔细胞培养板中，放置于37℃，5% CO2培养箱中培养。吸除细胞培养板中的细胞生长液，在每孔中加入1 ml的DCFH-DA(10 μmol/L)，放置于37℃孵育反应30 min后，期间每5 min震荡混匀1次。在细胞中加入不含有胎牛血清的细胞生长液洗涤细胞两次，放置于显微镜下观察后，用流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度。

1.2.5Western印迹检测p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、Bcl-2、Bax表达水平 处于对数生长期的心肌细胞，弃掉细胞生长液，在细胞中加入细胞裂解液，放置于冰上孵育裂解50 min，转移细胞裂解液至离心管中，放置于4℃，16 000 r/min离心15 min。吸取蛋白上清，按照BCA蛋白浓度检测试剂盒检测提取的蛋白浓度。提取的蛋白经变性后，加入到上样孔中，每孔加入变性蛋白样品50 μl。SDS-PAGE电泳初始电压为80 V，终末电压为120 V。电泳结束后，取出蛋白凝胶，按照常规方法转膜，4℃转膜过夜。聚偏氟乙烯(PVDF)膜经封闭液封闭后，加入一抗孵育反应后，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗涤3次，加入辣根过氧化物标记的二抗反应后，滴加显色剂，在暗室中曝光，分析蛋白表达水平。

1.3统计学方法 应用SPSS22.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1MTT检测细胞增殖结果 高糖组心肌细胞增殖与对照组相比明显受到抑制(Plt;0.01)，并且高糖对心肌细胞具有一定的毒性作用。实验组中加入了姜黄素，心肌细胞增殖明显高于高糖组(Plt;0.01)。见表1。

2.2流式细胞仪检测细胞凋亡结果 高糖组心肌细胞凋亡率明显高于对照组(Plt;0.01)；实验组心肌细胞凋亡率明显低于高糖组(Plt;0.01)。Western印迹结果显示，高糖组心肌细胞中Bcl-2的表达水平明显低于对照组(Plt;0.01)；高糖组心肌细胞中Bax的表达水平明显高于对照组(Plt;0.01)；实验组心肌细胞中Bcl-2的表达水平明显高于高糖组(Plt;0.01)；实验组心肌细胞中Bax的表达水平明显低于高糖组(Plt;0.01)。见表2。

表1 各组细胞OD值

与对照组比较：1)Plt;0.01；与高糖组比较：2)Plt;0.01；下表同

表2 细胞凋亡率及Bcl-2、Bax表达水平

2.3DCFH-DA探针检测活性氧水平结果 高糖组心肌细胞中荧光强度(19.64±1.58)明显高于对照组(10.02±1.05，Plt;0.01)；实验组心肌细胞中荧光强度(14.68±1.23)明显低于高糖组(Plt;0.01)。

2.4Western印迹法检测p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达结果 对照组、高糖组和实验组心肌细胞中JAK2、STAT3表达水平没有明显变化；高糖组心肌细胞中p-JAK2、p-STAT3表达水平显著低于对照组(Plt;0.01)，实验组心肌细胞中p-JAK2、p-STAT3表达水平明显高于高糖组(Plt;0.01)。见表3。

表3 p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3表达水平

3 讨 论

姜黄素作为一种植物色素，具有安全无毒的优点，临床上广泛用于肿瘤的治疗。姜黄素对癌细胞增殖、侵袭和转移具有抑制作用〔7〕。姜黄素促进大鼠神经干细胞的增殖分化，具有治疗阿尔兹海默氏病的作用〔8〕。有研究表明，姜黄素可以有效改善果糖摄入过多引发的肾脏损害，对心肌缺血损伤具有明显的治疗作用〔9〕。本研究结果发现，高糖环境下心肌细胞增殖明显受到抑制，并且高糖环境对细胞造成了一定的毒性作用。在细胞中加入姜黄素后，高糖环境对心肌细胞的增殖抑制作用明显减弱。

细胞凋亡是一种受多种基因共同调控的细胞死亡。细胞凋亡异常与疾病的发展具有密切关系。Bcl-2蛋白家族是目前研究最多的凋亡相关蛋白。根据细胞凋亡过程中的作用，可以将Bcl-2蛋白家族分为两种，一种是抑制细胞凋亡的蛋白，一种是促进细胞凋亡的蛋白〔10〕。Bcl-2在细胞凋亡过程中发挥抑制作用，而Bax在细胞凋亡过程中发挥促进作用〔11〕。本研究结果发现，高糖环境下心肌细胞凋亡增多，而加入姜黄素后的心肌细胞凋亡程度有所减弱；进一步研究发现，高糖环境下Bcl-2蛋白表达下降，而Bax蛋白表达升高。加入姜黄素后的心肌细胞中Bcl-2蛋白表达增多，Bax蛋白表达减弱。说明姜黄素抑制高糖环境下的心肌细胞凋亡是通过作用于Bcl-2、Bax蛋白表达实现的。

氧化应激导致的活性氧增多是糖尿病患者机体损伤的重要组成部分。高糖环境下，抗氧化酶活性受到抑制，导致机体内氧化环境平衡失调。检测活性氧水平的高低可以间接反映心肌细胞的损害程度〔12〕。活性氧水平越高，说明心肌细胞损害程度越大。本研究高糖环境中心肌细胞中的活性氧水平升高，加入姜黄素后的心肌细胞中活性氧水平出现明显下降。提示高糖环境对心肌细胞具有一定程度的氧化损伤，而姜黄素可以有效减缓这一损伤。

酪氨酸蛋白激酶2/信号转导子和转录激活子(JAK2/STAT3)参与细胞凋亡的信号转导〔13〕。JAK蛋白家族广泛存在于细胞质中，由JAK1、JAK2、JAK3和TYR2组成〔14〕。STAT3是STAT蛋白家族中的一员。JAK2/STAT3参与机体氧化应激反应、胚胎发育、组织器官形成和细胞凋亡、细胞损伤等一系列生命活动。JAK2/STAT3参与肿瘤、肾脏疾病、肝炎、心血管疾病的发生。本研究发现高糖环境下心肌细胞中p-JAK2、p-STAT3表达水平有所下降，而姜黄素可以有效抑制高糖环境造成的这种变化。说明高糖环境下，JAK2/STAT3信号通路受到抑制，姜黄素可以激活JAK2/STAT3信号通路发挥生物学作用。

综上所述，高糖环境对心肌细胞增殖有抑制作用，对心肌细胞凋亡具有促进作用。姜黄素可以通过作用于JAK2/STAT3信号通路缓解高糖环境下心肌细胞增殖抑制、凋亡增多，对心肌细胞损伤具有一定的改善作用。

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2杨俊朋,沈晓蕾,闫淑芳,等.糖尿病冠心病患者心肌细胞中磷脂酰基转移酶 1 水平的变化及影响因素分析〔J〕.中国糖尿病杂志,2016;24(3):245-9.

3刘 爽,刘晓玲,张 勇,等.黄芪多糖对 CVB3 感染的心肌细胞和心肌的保护作用研究〔J〕.中国分子心脏病学杂志,2015;15(4):1407-11.

4Zhang J,Xu DL,Liu XB,etal.Darapladib,a lipoprotein-associated phospholipase A2 inhibitor,reduces Rho kinase activity in atherosclerosis〔J〕.Yonsei Med J,2016;57(2):321-7.

5Yu YP,Huang XM,Fu YF.Curcumin protects H9c2 cardiomyocyte against ischemia/reperfusion injury through inactivation of glycogen synthase kinase-3〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2016;9(3):3226-32.

6Rahmaniyan M,Li L,Garcia J,etal.Curcumin mediated apoptosis in human neuroblastoma cells via ROS and sphingolipid generation〔J〕.Cancer Res,2016;76(14):2479.

7Basha RM,Connelly SF,Purnachandra G,etal.Tolfenamic acid and curcumin treatment induces pancreatic cancer cell growth inhibition via suppressing Sp1 expression,NF-κB translocation to nucleus〔J〕.Cancer Res,2016;76(14):4818.

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11Fan H,Liang Y,Jiang B,etal.Curcumin inhibits intracellular fatty acid synthase and induces apoptosis in human breast cancer MDA-MB-231 cells〔J〕.Oncol Rep,2016;35(5):2651-6.

12张 静,余 鹏,余树春,等.七氟醚后处理对大鼠心肌缺血再灌注氧化应激的影响〔J〕.中华老年心脑血管病杂志,2016;18(6):636-40.

13Chen YC,Chien LH,Huang BM,etal.Aqueous extracts of toona sinensis leaves inhibit renal carcinoma cell growth and migration through JAK2/STAT3,Akt,MEK/ERK,and mTOR/HIF-2α pathways〔J〕.Nutr Cancer,2016;68(4):654-66.

14赵国玉,李梦媛,崔 川,等.黄芪多糖对急性心肌梗死模型大鼠早期心功能、氧化应激及血清核转录因子-κB、脂肪因子水平的影响〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(13):3144-7.

〔2017-06-12修回〕

(编辑 袁左鸣)

R542.2

A

1005-9202(2017)22-5490-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.003

国家自然科学基金(No.81270184)；国家留学回国人员科技活动项目(No.国人厅〔2006〕164号)

夏 豪(1966-)，男，博士，主任医师，主要从事心血管内科疾病研究。

邓士兵(1982-)，男，主治医师，主要从事心血管内科、冠脉介入和心力衰竭研究。