Kiss-1在胃腺癌组织中的表达及对胃腺癌MKN-45细胞增殖、迁移能力的影响

王 欣 李宜炯 庞 超 杨艳红 张瑞华 朱振龙 王政民

(河北医科大学第一医院病理科，河北 石家庄 050031)

Kiss-1在胃腺癌组织中的表达及对胃腺癌MKN-45细胞增殖、迁移能力的影响

王 欣 李宜炯1庞 超 杨艳红 张瑞华 朱振龙 王政民

(河北医科大学第一医院病理科，河北 石家庄 050031)

目的探讨肿瘤抑制因子(Kiss)-1在胃腺癌组织中的表达及对胃腺癌细胞增殖、迁移能力的影响。方法qRT-PCR检测50例胃腺癌组织和对应的癌旁组织中Kiss-1水平。分别将Kiss-1小干扰RNA(siRNA Kiss-1)和对照小RNA(siRNA control)、Kiss-1过表达载体(p EGFP-N1-Kiss-1)和对照空载体(p EGFP-N1)转染至胃腺癌细胞株(MKN-45)中，培养48 h后，Western印迹检测细胞中Kiss-1、基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-2、β-连环蛋白(β-catenin)、C-myc蛋白水平，噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖能力，细胞划痕实验检测细胞迁移能力。用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535作用胃腺癌细胞后，检测细胞增殖和凋亡情况。结果Kiss-1在胃腺癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织(Plt;0.01)。p EGFP-N1-Kiss-1组细胞存活率和迁移率显著低于p EGFP-N1组，siRNA Kiss-1组显著高于siRNA control组(Plt;0.01)。p EGFP-N1-Kiss-1组细胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc水平显著低于p EGFP-N1组，siRNA Kiss-1组显著高于siRNA control组(Plt;0.01)。抑制剂作用后的胃腺癌细胞增殖迁移趋势与p EGFP-N1-Kiss-1组一致。结论Kiss-1在胃腺癌组织中低表达，Kiss-1通过Wnt/β-catenin信号通路抑制胃腺癌细胞增殖迁移能力。

胃腺癌；肿瘤抑制因子；迁移；Wnt/β-catenin信号通路

胃腺癌是胃癌的一种，由胃腺体细胞恶化产生〔1〕。胃腺癌的发病率占全部胃癌发病率的95%〔1〕。肿瘤抑制因子(Kiss)-1最初发现于黑素瘤细胞株中，是一种与肿瘤转移密切相关的基因〔3〕。Kiss-1广泛存在于正常的组织和器官中，在小肠、胎盘、睾丸、脑等组织中均具有不同程度的表达〔4〕。研究表明，Kiss-1参与膀胱癌、甲状腺癌、子宫内膜癌等多种癌症的转移，在乳腺癌细胞、宫颈癌细胞增殖迁移过程中发挥抑制作用〔5，6〕。本研究运用qRT-PCR检测胃腺癌组织中Kiss-1水平，并探讨Kiss-1对胃腺癌细胞增殖迁移的影响。

1 材料与方法

1.1一般材料 组织及细胞：收集2010年8月至2013年3月在河北医科大学第一医院确诊切除的50例胃腺癌患者的胃腺癌组织和对应的癌旁组织，其中男33例，女17例，平均年龄(58.47±12.34)岁。胃腺癌细胞株(MKN-45)购于河北医科大学病理教研室。主要仪器及试剂：p EGFP-N1-Kiss-1由本实验室保存；胰蛋白酶、DMEM、青链霉素均购于美国Sigma；Kiss-1、基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-2、β-连环蛋白(β-catenin)、C-myc单克隆抗体均购于北京鼎国生物科技有限公司；CO2培养箱购于美国Thermo；倒置显微镜购于日本尼康。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR检测组织中Kiss-1水平 50例胃腺癌组织和对应的癌旁组织剪碎后，在液氮中研磨成粉状。取出100 mg组织粉末，加入Trizol裂解液1 ml，依次用氯仿、异丙醇抽提后，用乙醇洗涤。加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后，用紫外分光光度计检测提取的RNA。按照反转录试剂盒说明书反转录合成Kiss-1 cDNA。按照qRT-PCR试剂盒说明书分析Kiss-1 mRNA水平。Kiss-1上游引物：5′-CCTCTGTGCCACCCACTTTG-3′；Kiss-1下游引物：5′-TGTAGTTCGGCAGGTCCTTCT-3′。

1.2.2细胞培养 取出保存在液氮罐中的胃腺癌MKN-45细胞，迅速放在37℃的水浴锅中融化后，加入含有10%胚牛血清(FBS)的DMEM细胞培养液，1 000 r/min离心10 min，加入5 ml细胞生长液悬浮细胞，种植于细胞培养瓶中，放置37℃，5% CO2培养箱中培养。观察细胞密度达到90%时，弃去细胞培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，加入0.25%的胰蛋白酶消化细胞，1 000 r/min离心10 min，弃酶消化液，加入细胞培养液悬浮细胞，接种到细胞培养瓶中培养。

1.2.3细胞转染 收集培养至对数生长期的胃腺癌MKN-45细胞，加入细胞生长液，接种到6孔细胞培养板中，放在37℃，5% CO2培养箱中培养24 h。分别将Kiss-1小干扰RNA(siRNA Kiss-1)和对照小RNA(siRNA control)、Kiss-1过表达载体(p EGFP-N1-Kiss-1)和对照空载体(p EGFP-N1)转染至胃腺癌细胞中，放置于37℃培养6 h后，更换成完全培养液继续培养。

1.2.4Western印迹检测转染后细胞中Kiss-1水平 收集转染48 h后的胃腺癌细胞，加入细胞裂解液，放置于冰上裂解细胞30 min。转移细胞裂解液至离心管中，4℃，12 000 r/min离心20 min。取蛋白上清液至EP管中。用二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒检测提取的蛋白样品浓度。蛋白样品与上样缓冲液充分混合后，100℃煮沸5 min。取变性蛋白样品加入到十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶(SDS-PAGE)上样孔中，电泳初始电压为80 V，电泳30 min后，调整电压为120 V至电泳结束。取出蛋白凝胶，在4℃转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。取出PVDF膜，加入5%脱脂奶粉封闭后，依次与一抗(600倍稀释)、二抗(1 000倍稀释)反应后，转移至暗室中，滴加显色液，曝光后，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，分析蛋白表达率。

1.2.5噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖 培养至对数生长期转染后的胃腺癌MKN-45细胞，加入胰蛋白酶消化细胞，离心后用细胞培养液悬浮细胞。调整每毫升细胞悬浮液中含有2×104个细胞，种植于96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬浮液100 μl。放置37℃，5% CO2培养箱中培养48 h后，在细胞中加入体积10 μl 5 mg/ml的MTT溶液，放在37℃孵育反应4 h。弃上清液，在细胞中加入100 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液。每组设置8个复孔，同时设置空白组，空白组中不加入细胞。观察结晶物完全融化后，放置于酶标仪上检测每孔的吸光度(OD值)，计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。

1.2.6细胞划痕实验检测细胞迁移 转染后胃腺癌MKN-45细胞培养至对数生长期后，加入胰蛋白酶消化细胞，离心后，在细胞沉淀中加入细胞培养液，接种到24孔细胞培养板中，放置37℃，5% CO2培养箱中培养过夜。用移液枪枪头小心在贴壁细胞中划出一条细痕，加入PBS洗涤。加入细胞生长液，在37℃，5% CO2培养箱中培养48 h。倒置显微镜下观察细胞划痕宽度，计算细胞迁移率，细胞迁移率=迁移的距离/划痕初始距离。

1.2.7Western印迹检测细胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc表达水平 胃腺癌与20 μmol/L Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535作用48 h后，收集细胞，提取细胞蛋白，Western印迹检测MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc水平。设置抑制剂FH535作用后的胃腺癌细胞为抑制剂组，同时设置对照组，对照组不加抑制剂。操作步骤同1.2.4。

1.3统计学方法 应用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差表示。

2 结 果

2.1Kiss-1在胃腺癌组织中的表达 胃腺癌组织中Kiss-1水平明显低于癌旁组织，差异显著(Plt;0.01)。

2.2转染后细胞中Kiss-1蛋白表达 siRNA control组和p EGFP-N1组细胞中Kiss-1蛋白水平没有变化。p EGFP-N1-Kiss-1组显著高于p EGFP-N1组。siRNA Kiss-1组显著低于siRNA control组(Plt;0.01)。见图1。

1：p EGFP-N1；2：p EGFP-N1-Kiss-1；3：siRNA control；4：siRNA Kiss-1；下图同图1 转染后胃腺癌细胞中Kiss-1表达水平

2.3Kiss-1对胃腺癌细胞增殖迁移能力的影响 p EGFP-N1-Kiss-1组细胞存活率和迁移率显著低于p EGFP-N1组，siRNA Kiss-1组显著高于siRNA control组(Plt;0.01)。

2.4Western印迹检测细胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc水平 p EGFP-N1-Kiss-1组细胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc水平显著低于p EGFP-N1组，siRNA Kiss-1组显著高于siRNA control组(Plt;0.01)。见图2。

2.5抑制Wnt/β-catenin信号通路对胃腺癌细胞增殖迁移能力的影响 抑制剂组细胞存活率和迁移率均显著低于对照组(Plt;0.01)。抑制剂组细胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc表达水平显著低于对照组(Plt;0.01)。见图3。

与p EGFP-N1组比较：1)Plt;0.01；与siRNA control组比较：2)Plt;0.01图2 细胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc表达水平检测结果

图3 抑制Wnt/β-catenin信号通路对胃腺癌细胞增殖迁移能力的影响

3 讨 论

Kiss-1基因位于1q32染色体上，编码的Kiss-1蛋白由145个氨基酸组成。有研究表明，Kiss-1在多种肿瘤组织中表达下调甚至缺失。Kiss-1能够抑制黑色素瘤细胞C8161在大鼠中的转移能力〔7〕。过表达Kiss-1的乳腺癌细胞株的迁移能力与对照组相比明显下降〔8〕。近年来研究表明，Kiss-1表达下调与甲状腺癌、子宫内膜癌等多种癌症的转移密切相关〔9〕。本研究收集了50例胃腺癌患者的胃腺癌组织和对应的癌旁组织，qRT-PCR检测结果发现Kiss-1在胃腺癌组织中表达下调。本研究结果提示，Kiss-1是一种抑癌基因。肿瘤细胞的增殖和迁移在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用。肿瘤细胞的迁移受多种基因的复杂调控〔10〕。MMP是目前研究最多的与肿瘤细胞迁移相关的蛋白家族〔11〕。MMP-2和MMP-9在肿瘤的转移过程中发挥关键作用〔12〕。本研究结果提示，Kiss-1可能是通过调控MMP-2和MMP-9作用于胃腺癌细胞。

Wnt/β-catenin信号通路广泛存在于真核生物体内，属于高度保守的信号通路〔13〕。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路中的关键效应因子，参与癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移过程〔14〕。C-myc是Wnt/β-catenin信号通路中的一个靶基因，调控癌细胞增殖过程，是一种癌基因〔15〕。FH535是Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂，能够特异性阻断Wnt/β-catenin信号通路的激活〔16〕。本研究结果提示，Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535能够减弱胃腺癌细胞的增殖和迁移能力。

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3Radhakrishnan P，Ruh N，Harnoss JM，etal.Prolyl hydroxylase 3 attenuates MCL-1-mediated ATP production to suppress the metastatic potential of colorectal cancer cells〔J〕.Cancer Res，2016；76(8)：2219-30.

4Lam K，Pan K，Linnekamp JF，etal.DNA methylation based biomarkers in colorectal cancer：a systematic review〔J〕.Biochim Biophys Acta，2016；1866(1)：106-20.

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6Moya P，Esteban S，Fernandez-Suarez A，etal.Kiss-1 methylation and protein expression patterns contribute to diagnostic and prognostic assessments in tissue specimens for colorectal cancer〔J〕.Tumor Biol，2013；34(1)：471-9.

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8Yaron M，Renner U，Gilad S，etal.KISS1 receptor is preferentially expressed in clinically non-functioning pituitary tumors〔J〕.Pituitary，2015；18(3)：306-11.

9Chaikhun T，Yanprapasiri C，Sotthibandhu P，etal.Kiss-1 mRNA/kisspeptin distribution in preoptic and arcuate nuclei of cycling buffalo (Bubalus bubalis) hypothalamus〔J〕.Paki Veterin J，2016;36(1)：93-7.

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〔2017-02-11修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

R73

A

1005-9202(2017)22-5530-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.019

河北省卫计委青年科技课题(20150642)

1 河北医科大学第一医院骨科

李宜炯(1982-)，男，硕士，主治医师，主要从事骨肿瘤研究。

王 欣(1982-)，女，硕士，主治医师，主要从事临床肿瘤病理研究。