鼻咽癌组织中TRPC1表达及其对鼻咽癌细胞生物学特性的影响

王佳蓉 陈翊民 吴瑞珊

(福建医科大学附属第二医院耳鼻喉科，福建 泉州 362000)

鼻咽癌组织中TRPC1表达及其对鼻咽癌细胞生物学特性的影响

王佳蓉 陈翊民 吴瑞珊

(福建医科大学附属第二医院耳鼻喉科，福建 泉州 362000)

目的探讨鼻咽癌组织中瞬时受时电位(TRPC)1的表达情况及其对鼻咽癌细胞生物学特性的影响。方法选择鼻咽癌组织标本80例和鼻咽慢性炎症标本80例；鼻咽癌C666-1细胞分为siRNA TRPC1组、阴性对照组、空白对照组。采用免疫组织化学法测定组织中 TRPC1蛋白的表达，采用Western印迹检测细胞中 TRPC1蛋白的表达，采用RT-PCR测定细胞中 TRPC1 mRNA的表达，采用Transwell实验测定细胞的侵袭能力。结果鼻咽癌组TRPC1蛋白阳性率高于鼻咽慢性炎症组(Plt;0.05)。si-TRPC1组C666-1细胞中TRPC1蛋白和TRPC1 mRNA的表达量均低于阴性对照组和空白对照组(Plt;0.05)。第3天和第5天si-TRPC1组C666-1细胞OD值低于阴性对照组和空白对照组(Plt;0.05)。si-TRPC1组C666-1细胞G1期比例高于阴性对照组和空白对照组(Plt;0.05)，S期比例低于阴性对照组和空白对照组(Plt;0.05)。si-TRPC1组C666-1细胞早期凋亡比例高于阴性对照组和空白对照组(Plt;0.05)，C666-1细胞侵袭力低于阴性对照组和空白对照组(Plt;0.05)。结论鼻咽癌组织中TRPC1蛋白呈高表达，沉默TRPC1基因后鼻咽癌细胞中TRPC1水平下降，TRPC1能够促进鼻咽癌细胞的增殖和侵袭能力，抑制鼻咽癌细胞凋亡。

鼻咽癌；瞬时受时电位；增殖；凋亡；细胞周期

鼻咽癌为我国高发恶性肿瘤之一，与EB病毒感染有关，主要采取放射治疗为主，化学治疗和手术为辅的综合治疗措施。鼻咽癌放疗后的5年生存率约为50%，但因其早期症状比较轻微、病灶比较小、发病部位隐蔽，给鼻咽癌的诊断带来一定困难。鼻咽癌周围淋巴组织丰富，使鼻咽癌更具有侵袭性和转移性，常常在出现临床症状前就已出现转移。鼻咽癌的远处转移和复发是导致其治疗失败的主要原因〔1～3〕，因此，探讨鼻咽癌的生物学特性具有重要意义。瞬时受时电位(TRPC)1为非选择性的钙离子、钠离子等阳离子通道，其和多种肿瘤细胞的增殖和迁移关系密切〔4～6〕。本文探讨鼻咽癌组织中TRPC1蛋白的表达情况及基因沉默TRPC1对鼻咽癌细胞生物学特性的影响。

1 资料与方法

1.1资料 选择福建医科大学附属第二医院2014年7月至2016年6月鼻咽活检确诊为鼻咽癌的石蜡标本80例作为鼻咽癌组，鼻咽活检确诊为鼻咽慢性炎症标本80例作为对照组。鼻咽癌组患者年龄(48.78±12.43)岁，男56例，女24例；对照组年龄(49.12±11.65)岁，男49例，女31例，两组患者性别和年龄比较差异无统计学意义。鼻咽癌TNM分期T1期18例，T2期33例，T3期19例，T4期10例，N0 21例，N1 30例，N2 19例，N3 10例；临床分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期23例，Ⅲ期24例，Ⅳ期29例。所有患者均资料完整，经病理组织学确诊。

细胞和主要试剂：鼻咽癌C666-1细胞(中国上海栩冉生物科技有限公司)，浓缩型鼠抗人TRPC1多克隆抗体(美国Hyclone公司)，siRNA TRPC1质粒和阴性对照质粒(广州瑞博生物科技公司)，胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培养基(美国Abcam公司)，BCA蛋白试剂盒、RT-PCR试剂盒、RNA提取试剂盒(美国Sigma公司)，Transwell小室(美国BD公司)等。

1.2采用免疫组织化学法测定鼻咽癌组织和鼻咽慢性炎症组织中TRPC1蛋白表达情况 将鼻咽癌组织和鼻咽慢性炎症组织石蜡切片脱蜡后，按照免疫组织化学试剂盒说明书进行染色，一抗为浓缩型鼠抗人TRPC1多克隆抗体。结果判定：胞质和胞膜中出现棕黄色颗粒为TRPC1阳性表达，根据细胞染色强度评分分为0～3分，根据阳性细胞比例评分分为0～4分，染色强度评分与阳性细胞评分的乘积作为免疫组化评分，免疫组化评分阴性为0～1分；+为3～5分；为6～8分；为9～12分，其中阳性为评分+、、例数之和。

1.3鼻咽癌C666-1细胞分组 鼻咽癌C666-1细胞分为3组：siRNA TRPC1组(鼻咽癌C666-1细胞转染siRNA TRPC1序列)；阴性对照组(鼻咽癌C666-1细胞转染阴性对照序列)；空白对照组(鼻咽癌C666-1细胞未进行转染)。

1.4转染后各组鼻咽癌C666-1细胞TRPC1蛋白表达测定 将鼻咽癌C666-1细胞用DMEM培养基培养，取生长良好的鼻咽癌C666-1细胞提取细胞总蛋白，以TRPC1单克隆抗体为一抗，以GAPDH为内参照，采用Western印迹检测鼻咽癌C666-1细胞TRPC1蛋白表达情况。

1.5转染后各组鼻咽癌C666-1细胞TRPC1 mRNA表达测定 将鼻咽癌C666-1细胞培养48 h后，提取鼻咽癌C666-1细胞总RNA，采用RT-PCR法测定鼻咽癌C666-1细胞中TRPC1 mRNA表达，反应条件：95℃ 5 min，94℃ 10 s，52℃ 10 s，72℃ 60 s，共30个循环。

1.6转染后各组鼻咽癌C666-1细胞增殖能力测定 取生长良好的各组鼻咽癌C666-1细胞接种到96孔板中，采用MTT法观察细胞的增殖情况，分别取第1、3、7天细胞测定570 nm波长处光密度值。

1.7转染后各组鼻咽癌C666-1细胞凋亡和细胞周期测定 采用流式细胞仪测定各组鼻咽癌C666-1细胞凋亡和细胞周期情况。

1.8转染后各组鼻咽癌C666-1细胞迁移能力测定 采用Transwell实验测定C666-1细胞的迁移能力。

1.9统计学方法 采用SPSS20.0软件，计数资料采用χ2检验；计量资料多组均数比较采用方差分析，组内两两比较采用LSD检验。

2 结 果

2.1鼻咽癌组织中TRPC1蛋白的表达情况 鼻咽癌组TRPC1蛋白阳性表达65例(81.3%)，明显高于鼻咽慢性炎症组〔15例(18.8%)〕(χ2=30.104,Plt;0.05)。见图1。

2.2基因沉默TRPC1后各组细胞中TRPC1蛋白mRNA表达情况 si-TRPC1组C666-1细胞中TRPC1蛋白和mRNA的表达均低于阴性对照组和空白对照组(Plt;0.05)。见表1和图2。

2.3基因沉默TRPC1后各组细胞增殖情况 第1天si-TRPC1组、阴性对照组和空白对照组C666-1细胞OD值比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)；第3天和第7天si-TRPC1组C666-1细胞OD值低于阴性对照组和空白对照组(Plt;0.05)。见表2。

图1 鼻咽癌组织和鼻咽慢性炎症组织中TRPC1蛋白的表达情况(DAB,×400)

组别TRPC1蛋白TRPC1mRNASi-TRPC1组0.387±0.0120.425±0.047阴性对照组0.853±0.0171)0.832±0.0581)空白对照组0.862±0.0321)0.847±0.0531)F/P值51.243/0.00034.267/0.000

与si-TRPC1组比较：1)Plt;0.05；下表同

图2 Western印迹测定TRPC1蛋白的表达情况

组别第1天第3天第7天si-TRPC1组0.342±0.0190.488±0.0471.126±0.084阴性对照组0.338±0.0210.721±0.0761)1.768±0.0921)空白对照组0.351±0.0170.736±0.0711)1.775±0.1011)F值0.95714.75163.264P值0.4250.0000.000

2.4基因沉默TRPC1后各组细胞周期变化情况 si-TRPC1组、阴性对照组和空白对照组C666-1细胞G2期比较差异无统计学意义(Pgt;0.05);si-TRPC1组C666-1细胞G1期比例高于阴性对照组和空白对照组(Plt;0.05)，S期比例低于阴性对照组和空白对照组(Plt;0.05)。见表3。

2.5基因沉默TRPC1后各组细胞凋亡变化情况 si-TRPC1组、阴性对照组和空白对照组C666-1细胞早期凋亡比例比较差异有统计学意义(Plt;0.05)，其中si-TRPC1组C666-1细胞早期凋亡比例(7.352%±0.183%)高于阴性对照组(3.782%±0.214%)和空白对照组(3.746%±0.201%，F=46.364,Plt;0.05)。

2.6基因沉默TRPC1后各组细胞侵袭力比较 si-TRPC1组C666-1细胞侵袭力(127.57±35.47)低于阴性对照组(214.35±37.68)和空白对照组(221.47±35.46，F=11.647,Plt;0.05)。见图3。

表3 各组细胞周期情况

图3 各组细胞侵袭力(×200)

3 讨 论

TRP离子通道包括7个亚家族，TRPC为其亚家族成员之一，TRPC亚家族包括TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7共7个亚型，TRPC1主要在心脏、肺、脑、肾脏、皮肤、骨骼肌、卵巢、睾丸、前列腺等组织中呈高表达。TRPC1可以和TRPC3形成一具体，是最早发现的哺乳动物TRP通道，其功能主要为参与钙依赖的、受体介导的腺体和平滑肌的收缩和分泌功能，参与介导钙离子的进入，维持体内钙离子和镁离子平衡，并和钙离子信号相关的多种生理过程有关，在细胞的分化、增殖、凋亡、迁移等过程中发挥重要作用。当细胞内钙库被消耗时，激活细胞上的TRPC1通道，使细胞内钙离子浓度增加，填充细胞内钙离子的不足。细胞内钙离子和肿瘤的发生发展关系密切，参与肿瘤的分化、生长、侵袭和转移，在增殖比较快的肿瘤细胞内钙离子水平比较高，阻断钙离子内流可以在一定程度上阻止肺癌、前列腺癌等恶性肿瘤细胞的生长〔7～9〕。能够调节细胞内钙离子浓度，从而抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和异常分化，从而引起肿瘤的浸润和扩散，在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥一定作用〔10，11〕。本文中鼻咽癌组TRPC1蛋白阳性率明显升高，考虑TRPC1在鼻咽癌的发生发展中发挥作用。

RNA干扰技术可以特异、有效、简单地下调细胞中目的基因的表达，在细胞信号转导、药物靶点筛选、功能基因组学等研究中被广泛应用〔12～16〕。本研究结果提示，TRPC1基因影响鼻咽癌C666-1细胞的生物学特性，能够促进C666-1细胞增殖，影响C666-1细胞周期，抑制C666-1细胞凋亡，促进C666-1细胞侵袭，在鼻咽癌的发生发展中发挥重要作用。TRPC1为钙离子通道，其促进鼻咽癌细胞增殖、抑制鼻咽癌细胞凋亡可能与其调节钙离子内流有关，细胞内钙离子浓度在细胞增殖和凋亡、血管生成和基因转录方面也发挥重要作用；当细胞膜上钙离子通道异常，细胞内钙稳态被破坏，则可促进细胞增殖、血管生成，抑制细胞凋亡，从而引起肿瘤的发生及转移。

1Strazzulla A，Barreca GS，Giancotti A，etal.Nasopharyngeal carcinoma：review of the literature with a focus on therapeutical implications〔J〕.Infez Med，2015；23(3)：224-9.

2Lee AW，Ma BB，Ng WT，etal.Management of nasopharyngeal carcinoma：current practice and future perspective〔J〕.J Clin Oncol，2015；33(29)：3356-64.

3Chua ML，Wee JT，Hui EP，etal.Nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Lancet，2016；387(10022)：1012-4.

4Fels B，Nielsen N，Schwab A.Role of TRPC1 channels in pressure-mediated activation of murine pancreatic stellate cells〔J〕.Eur Biophys J，2016；45(7)：657-70.

5张 骏，朱 震，李雄伟，等.SiRNA沉默TRPC1基因对肺腺癌A549细胞增殖和侵袭的影响〔J〕.中华医学杂志，2013；93(28)：2241-3.

6Lepannetier S，Zanou N，Yerna X，etal.Sphingosine-1-phosphate-activated TRPC1 channel controls chemotaxis of glioblastoma cells〔J〕.Cell Calcium,2016；60(6)：373-83.

7钟长江，岳喜磊，李建华，等.TRPC1在 TGF-β1诱导支气管上皮细胞迁移中的作用〔J〕.中国病理生理杂志，2016；32(2)：267-72.

8Selli C，Pearce DA，Sims AH，etal.Differential expression of store-operated calcium-and proliferation-related genes in hepatocellular carcinoma cells following TRPC1 ion channel silencing〔J〕.Mol Cell Biochem,2016；420(1-2)：129-40.

9阮 健，蔡红兵，罗 兰，等.TRPC1对人肾癌细胞A498增殖和迁移的影响〔J〕.热带医学杂志，2016；16(7)：825-8.

10Faouzi M，Hague F，Geerts D，etal.Functional cooperation between KCa3.1 and TRPC1 channels in human breast cancer：Role in cell proliferation and patient prognosis〔J〕.Oncotarget,2016；7(24)：36419-35.

11Guéguinou M，Harnois T，Crottes D，etal.SK3/TRPC1/Orai1 complex regulates SOCE-dependent colon cancer cell migration：a novel opportunity to modulate anti-EGFR mAb action by the alkyl-lipid Ohmline〔J〕.Oncotarget,2016；7(24)：36168-84.

12Feijó RG，Braga AL，Lanes CF，etal.Silencing of gonad-inhibiting hormone transcripts in litopenaeus vannamei females by use of theRNA interference technology〔J〕.Mar Biotechnol (NY),2016；18(1)：117-23.

13俞芽法，郑振中.Fgl2-shRNA基因沉默对糖尿病大鼠心功能的改善及心肌病理形态变化〔J〕.西安交通大学学报(医学版)，2015；36(5)：605-8.

14Gonzalez-Rodriguez A，Valverde AM.RNA interference as a therapeutic strategy for the treatment of liver diseases〔J〕.Curr Pharm Des，2015；21(31)：4574-86.

15张 伟，刘雪芹，苗 苗，等.20S蛋白酶体β5亚单位基因沉默对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响〔J〕.解剖学杂志，2015；38(2)：153-6.

16Iulia Irimie A，Braicu C，Zanoaga O，etal.Inhibition of tumor necrosis factor alpha using RNA interference in oral squamous cell carcinoma〔J〕.J BUON，2015；20(4)：1107-14.

〔2017-01-15修回〕

(编辑 徐 杰)

R76

A

1005-9202(2017)22-5538-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.022

福建省科技厅项目(2016J01521)

王佳蓉(1973-)，女，硕士，副主任医师，主要从事过敏性鼻炎的基础和临床研究。