内质网应激PERK通路在脑泰方提取物保护局灶性脑缺血大鼠海马神经元中的作用

石咏梅 马英民 廖 君 易亚乔 余清平 黄 娟 葛金文

(湖南中医药大学中医学院解剖教研室，湖南 长沙 410208)

内质网应激PERK通路在脑泰方提取物保护局灶性脑缺血大鼠海马神经元中的作用

石咏梅 马英民1廖 君 易亚乔2余清平 黄 娟3葛金文3

(湖南中医药大学中医学院解剖教研室，湖南 长沙 410208)

目的探讨中药复方脑泰方(NTF)提取物(NTE)对局灶性脑缺血的治疗作用及其对内质网应激 PERK通路的干预作用。方法自备NTE连续灌胃7 d后，在体制备大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，观察术后大鼠的神经行为,同时使用Nissl染色观察神经元凋亡情况，使用免疫组织化学、Western及RT-qPCR观察内质网应激PERK通路相关蛋白的表达。结果NTE对大鼠脑缺血后的行为有一定的改善作用；NTE可明显增加MCAO后海马CA1区神经元的存活。NTE从术后12 h开始抑制PERK通路p-PERK的表达，明显促进GRP78蛋白的表达，抑制术后CHOP蛋白的表达,尤其在术后24 h。RT-qPCR结果显示NTE可以显著降低MCAO术后72 h海马CA1区神经元内CHOP的表达。结论NTE对脑缺血具有治疗作用，其可能的机制是抑制内质网应激PERK通路，尤其是在脑缺血的早期。

内质网；缺血；海马；神经元；PERK；脑泰方

研究显示〔1～4〕，脑缺血引起的细胞损伤，一般集中体现在线粒体损伤、缺血区迟发性细胞死亡、钙离子超载、自由基损伤等方面。脑组织一旦缺血，生成的自由基、ATP损耗、钙离子超载均会造成高尔基体、线粒体、内质网等多种细胞器结构功能变化。同时，细胞器出现应激后，可以将其作为判定脑损伤程度的黄金标准。在真核细胞中〔5〕，内质网广泛存在，主要负责分泌、合成、转运、加工蛋白；并且，内质网能够使钙离子保持平衡，具有非常重要的作用。内质网还是运转、质控、折叠蛋白的中心细胞器，能够通过调解体积适应细胞的合成、代谢等生理需求。缺氧、缺血、应激、低氧等状态，有可能引发内质网失调。

本文拟研究益气活血方对局灶性脑缺血后内质网功能的影响。

1 材料与方法

1.1动物 湖南中医药大学实验动物中心成年且健康的SD大鼠120只，重量220～250 g，雄性。

1.2药物制备及使用方法 复方脑泰方提取物(NTE)：由黄芪、川芎、地龙和僵蚕组成，用2 500 ml浸泡4～6 h后，文火煎煮，提纯后得到膏粉。使用前，同生理盐水调成高、中、低三个浓度，即每200 ml生理盐水中分别加入15.42 g、7.71 g、3.86 g NTF。治疗前，使用尼莫地平进行对照，将其配制成浓度3.2 mg/ml。各组均于术前7 d开始每天1次按每100 g大鼠1 ml使用灌胃法给予相应药物，模型组给予生理盐水(NS)。

1.3动物模型 根据脑部结构制作模型。仰卧位，按照颈部中线切开，注入麻醉药物，然后在距离左侧颈总动脉(CCA)4 mm处切开一个小口，将栓线插入到颈内动脉(ICA)，插入深度为(22±0.5)mm。神经行为学评分判断造模是否成功。模型成功大鼠分别于术后6、12、24、48、72 h取材，进行相关形态学和分子生物学检测。

1.4实验方法

1.4.1神经行为学评分 采用Longa评分法,0分，无障碍；1分，前肢无法前倾；2分，可以向一侧翻转；3分，可以向一侧倾倒；4分，无自主活动。

1.4.2Nissl 染色 常规麻醉，灌注，取大脑半球置于4℃4%多聚甲醛中固定。冰冻切片置于75%酒精浸泡，冲洗后置于0.1% Nissl染液中10～15 min(镜下观察决定染色时间)，镜下观察。

1.4.3免疫组织化学 石蜡切片脱蜡，复水，按试剂盒说明进行实验。显微镜下观察葡萄糖调节蛋白(GRP)78和c/EBP家庭同源蛋白(CHOP)的表达情况，染色阳性反应物为棕黄色颗粒。

1.4.4Western印迹 活体取大鼠海马，加入5倍体积缓冲液匀浆，离心取上清，蛋白浓度用Lowry法蛋白定量；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳,点样顺序依次是模型组术后6 h(M6)、12 h(M12)、24 h(M24)、48 h(M48)及NTE组术后6 h(NTE6)、12 h(NTE12)、24 h(NTE24)和48 h(NTE48)。免疫检测:加封闭液1 h，依次加入一抗和二抗，电化学增强发光法(ECL)免疫检测试剂盒进行显色，曝光，照相。结果采用IPP6.0图像分析系统分析，得出相应的IOD值和与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)的比值。蛋白表达量与IOD值呈正相关。

1.5RT-qPCR检测相关基因的表达 提取RNA进行逆转录;1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA纯度;测RNA浓度;第一链cDNA合成;real-time PCR检测(Bio-Rad CFX Connect)。引物序列见表1。检测所得CT值利用2-△△CTlivak 方法计算目的基因的相对表达量。

1.6统计学方法 应用SPSS18.0软件行单因素方差分析。

表1 CHOP及β-actin扩增引物序列

2 结 果

2.1神经行为学评分 中剂量〔(2.1±0.28)分〕和高剂量〔(1.8±0.09)分〕NTE可以显著降低MCAO后大鼠的神经行为学评分,模型组评分(2.8±0.45)分，低剂量NTE组为(2.2±0.31)分，尼莫地平组为(2.0±0.24)分。提示NTE可以明显改善缺血后大鼠的自主行为能力，促进功能的恢复。

2.2Nissl 染色 使用NTE后，单位面积内大鼠海马CA1区存活的神经元数量〔低、中、高剂量组分别为(23.2±3.16)、(25.6±0.45)、(30.8±2.65)个〕与模型组〔(12.5±1.14)个〕相比显著提高(Plt;0.05)；尼莫地平组神经元数量为(27.5±1.57)个。见图1。

2.3免疫组织化学 GRP78阳性产物呈棕黄色颗粒，主要位于神经元胞质内，模型组自术后6 h表达水平逐步上调，至24 h达高峰，72 h后显著下调；使用NTE干预后，术后GRP78表达明显上调，至72 h表达水平仍然显著高于模型组。见图2。CHOP阳性产物呈棕黄色颗粒，主要位于神经元胞核内。模型组自术后6 h表达水平逐步上调，24 h表达显著上调并维持在高水平，72 h后表达又进一步明显上调。使用NTE干预后术后24 h表达水平显著低于模型组。见图2，图3。

2.4Western印迹检测结果 使用NTE后缺血大鼠海马CA1区神经元 CHOP的表达显著低于模型组，尤其是在术后24 h；GRP78的表达显著高于模型组；而p-PERK的表达在术后12 h开始明显低于模型组。见图4，表2。

2.5RT-qPCR结果 与模型组相比，在MCAO后6 h和12 h，NTE组CHOP mRNA的相对表达量较高,48 h后开始下降，72 h后显著降低。见图5。

图1 MCAO术后72 h Nissl染色(×400)

图2 MCAO术后24 h免疫组化检测各组GRP78表达(DAB，×400)

图3 MCAO术后72 h免疫组化检测各组CHOP表达(DAB，×400)

组别p-PERKGRP78CHOPM6组0.08±0.000.10±0.0041)0.76±0.071)M12组0.14±0.011)0.25±0.031)0.92±0.091)M24组0.14±0.011)0.34±0.051)1.08±0.081)M48组0.16±0.011)0.15±0.011)0.94±0.071)NTE6组0.13±0.010.43±0.070.67±0.02NTE12组0.10±0.000.39±0.060.56±0.03NTE24组0.09±0.000.44±0.050.55±0.03NTE48组0.10±0.000.25±0.030.56±0.04

与同时间点NTE组比较：1)Plt;0.05

1～9依次为：NTE6、NTE12、NTE24、NTE48、M6、M12、M24、M48、空白对照组图4 Western印迹检测p-PERK、GRP78、CHOP蛋白表达

与同时间点NTE组比较：1)Plt;0.05图5 模型组、NTE组CHOP mRNA表达

3 讨 论

一般情况下，内质网伴侣会和三种内质网上的ERS应激早期激活未折叠蛋白反应(UPRER)蛋白相融合，从而让其失去活性。ERS早期激活PERK，PERK(PKR-like ER kinase)即蛋白激酶样ERS激酶，是一次跨膜的ERS驻留蛋白质,与肌醇需求激酶(IRE)1相类似，同属于Ⅰ型跨膜蛋白。其N端位于ERS腔，C端位于细胞质，包括一个蛋白激酶结构域。其腔内的应激感应结构域在生物起源上有一定的关联,而且结构和功能也相类似。有实验已经证明〔6〕，两者可以互换，以降低细胞负载。ERS是磷酸被激活形成的活性形式〔7〕，p-PERK作用于真核细胞翻译起始因子eIF2α，具有抑制翻译效果，减轻细胞负担。然而，现如今的研究资料显示，如果应激现象一直存在，会导致ERS死亡(ERAD)，也就是细胞凋亡。

ERS与癌症、代谢紊乱、感染性疾病、骨质疏松和神经系统退行性疾病(帕金森病)密切相关〔8〕。进一步的研究表明脑缺血性疾病、脑的缺血再灌注损伤也与ERS相关〔9，10〕。在局灶性脑缺血后，海马神经元PERK通路蛋白表达出现了明显变化。首先,在脑缺血的早期，海马CA1区神经元内就有明显的GRP78表达，缺血24 h后表达量最高。随后表达逐步下调。使用NTE干预后海马CA1区神经元内GRP78表达明显上升。Min等〔11〕发现使用2-脱氧-D-葡萄糖后缺血再灌注大鼠神经元GRP78的表达在12 h后显著上调。其次,缺血引起海马神经元内PERK的活化(p-PERK),这种作用可以在术后12 h被NTE所抑制。PERK的活化是ERS的一条重要途径〔12〕，Gu等〔13〕发现川芎和赤芍的混合提取物能够通过抑制ERS通路蛋白PERK及其下游蛋白eIF2α和CHOP的表达进而起到抑制MCAO术后大鼠基底前脑神经元凋亡的作用。研究发现，PERK激活导致的神经元CHOP表达也可被NTE下调，然而CHOP蛋白和基因表达被抑制的时间却并不相同，这还需要进一步的实验去探讨。Cao等〔14〕发现申脉散的提取物益气复脉(YQFM)粉可以抑制ERS通路标志蛋白CHOP的表达。滋阴补脾药物血清能够抑制内质网应激(主要是通过抑制CHOP的表达)引起的神经元凋亡〔15〕。

综上所述，NTE对脑缺血具有治疗作用，其可能的机制是抑制内质网应激PERK通路，尤其是在脑缺血的早期。

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〔2017-05-17修回〕

(编辑 袁左鸣)

R741

A

1005-9202(2017)22-5512-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.012

国家自然科学基金委员会青年项目(No.81303078)；湖南省教育厅项目(No.13C699)；湖南省中医药管理局项目(No.201593)资助

1 长沙市中心医院耳鼻喉科

2 湖南中医药大学中医学院仲景教研室

3 湖南中医药大学中西结合学院

葛金文(1965-)，男，教授，博士后，博士生导师，主要从事脑血管病的中医药防治研究。

石咏梅 (1979-)，女，在读博士，讲师，主要从事脑血管病的中医药防治研究。