糖尿病肾病大鼠铁超载对内皮功能及氧化应激的影响

韩立坤 李明举 毛 宇 张天资

(内蒙古民族大学临床医学院，内蒙古 通辽 028000)

糖尿病肾病大鼠铁超载对内皮功能及氧化应激的影响

韩立坤 李明举1毛 宇 张天资

(内蒙古民族大学临床医学院，内蒙古 通辽 028000)

目的探讨糖尿病肾病(DN)大鼠铁超载后对内皮功能及氧化应激的影响。方法将采用随机数字法30只健康雄性Wistar大鼠分为正常对照组(NC组)10只和糖尿病模型组20只，糖尿病模型组按65 mg/kg体重单次腹腔注射链脲佐菌素。将20只造模成功的大鼠仍按随机数字法分为DN组10只和铁超载组(Fe组)10只。NC组和DN组继续给予普通全价颗粒饲料，Fe组给予高铁饲料，喂养12 w。实验结束前1 d收集24 h尿液测量尿白蛋白，计算尿白蛋白排泄率(UAER)；心脏采血检测血清铁(SI)、总铁结合力(TIBC)、组织铁(TI)、内皮素(ET)-1、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)等相关指标；观察肾脏及肝脏病理情况；制备肾组织匀浆检测一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(T-SOD)及丙二醛(MDA)。结果Fe组大鼠的肾重/体重(KW/BW)显著高于DN组(Plt;0.05)。Fe组血糖、UAER、Scr、BUN、SI、TI显著高于DN组(Plt;0.01)，TIBC显著低于DN组(Plt;0.01)；肾组织NO、NOS显著低于DN组，ET-1显著高于DN组(Plt;0.01)；T-SOD显著低于DN组(Plt;0.01)，MDA显著高于DN组(Plt;0.01)。结论铁超载能促进DN的发生与发展，机制可能与血糖水平升高、内皮功能障碍及氧化应激有关。

铁超载；糖尿病肾病；内皮功能；氧化应激

近年研究发现糖尿病慢性并发症的共同机制是线粒体活性氧簇(ROS)生成过多〔1〕，氧化应激在糖尿病肾病(DN)的发病机制中也具有重要的作用〔2〕。同时也有研究表明血管内皮功能受损可能是DN的启动因素〔3〕。铁是人体内含量最多的必需微量元素，由铁产生的ROS可能是DN重要的损伤机制〔4〕，因此机体内铁超载可能会导致和加重DN的发生、发展〔5，6〕，但是铁超载状态下血管内皮功能状态的改变未见报道。本文旨在探讨DN大鼠铁超载是否可促进DN的进展及铁超载时氧化应激和血管内皮功能状态，从而阐明铁促进DN进展的作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级健康雄性Wistar大鼠30只〔购自长春亿斯实验动物研究所，动物生产许可证号：SCXK(吉)-2011-0004〕，体重(250±10)g，鼠龄6～7 w。

1.2主要仪器与试剂 PD-G001-1百捷血糖仪及试纸(台湾台北勤立生物科技股份有限公司)；BWS-5恒温水槽与水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；HS-100C恒温摇床(上海和呈仪器制造有限公司)；T6新世纪紫外可见分光光度仪(北京普析通用仪器有限责任公司)；IKA-YLTRA-TUTTAXT8型匀浆机(德国IKA公司)。链脲佐菌素(STZ)购自北京索莱宝科技有限公司。血清铁(SI)试剂盒、总铁结合力(TIBC)试剂盒、组织铁(TI)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3DN模型的制备及分组 实验大鼠普通全价颗粒饲料(购于北京华阜康生物科技股份有限公司)适应性饲养1 w，模型组(n=20)禁食12 h后，按65 mg/kg体重计算，单次腹腔注射1%的STZ溶液(0.1 mol/L无菌枸橼酸钠缓冲液，按pH4.5配制，用前冰中低温避光保存。现配现用，10 min内用完)。正常对照组(NC，n=10)给予相同体积的无菌枸橼酸钠缓冲液单次腹腔注射。60 h后禁食12 h，自由饮水，尾静脉采血，空腹血浆葡萄糖≥16.7 mmol/L且尿蛋白排泄率﹥20 mg/24 h提示DN造模成功〔7〕。将造模成功的20只大鼠采用随机数字法分为铁超载组(Fe，n=10)和DN组(n=10)。造模成功后先用普通全价颗粒饲料喂养1 w，1 w后Fe组大鼠给予高铁饲料(在普通全价颗粒饲料的基础上每1 000 g添加金属元素铁1 000 mg，购于北京华阜康生物科技股份有限公司)，NC组和DN组大鼠继续给予普通全价颗粒饲料喂养；实验期间每7 d称量体重，每4 w用代谢笼收集24 h尿液并测定空腹血糖(FPG)，持续12 w。在整个实验过程中，大鼠自由摄食和饮水，不使用任何降糖药物及皮下注射胰岛素。12 w后采血分离血清，测SI、血清铁蛋白，Fe组明显增高，确定造模成功。

1.4标本收集 实验结束前1 d各组大鼠禁食、自由饮水用代谢笼准确收集24 h尿液测出尿量，新鲜尿液以3 000 r/min，4℃离心10 min，去除沉淀，-20℃保存，以检测尿白蛋白定量并计算尿白蛋白排泄率(UAER)。实验结束时称量体重，按50 mg/kg体重腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，心脏穿刺采血，注入一次性真空抗凝采血管中，静置后以3 500 r/min，4℃离心15 min，取上清后存放于-20℃冰箱中保存待测。

1.5指标检测 SI、TIBC、TI、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、内皮素(ET)1、SOD、MDA、Scr、BUN和UAER等相关指标，严格按照各项指标的试剂盒说明书对其进行测定并计算。

1.6肾脏指数测定及肾脏组织匀浆制备 心脏采血后迅速摘除双侧肾脏，用冰生理盐水冲洗后滤纸吸干。肾脏剔除被膜后称量质量，计算脏器指数。肾脏指数(%)=肾脏质量(KW，mg)/体质量(BW，g)。取部分肾组织称重，按质量与体积1∶9的比例，量取冷生理盐水，用匀浆机充分研碎使组织匀浆化。将制备好的10%组织匀浆，以3 500 r/min，4℃离心10 min，用移液器抽取离心后匀浆液的上清液，存放于-20℃冰箱中保存待测。

1.7肝脏、肾脏组织病理学观察 心脏采血后迅速摘除肝脏，24 h后肝组织行普鲁士蓝染色观察肝组织内铁沉积情况；肾脏摘除后左肾沿纵轴剖开，立即用4%多聚甲醛固定，进行苏木素-伊红(HE)染色观察病理形态学变化。

1.8统计学处理 采用SPSS19.0统计学软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组一般体征及肾重指数比较 造模成功大鼠开始出现明显的多饮、多食、多尿、逐渐消瘦、精神萎靡，至实验结束DN组、Fe组各死亡1只。12 w末与NC组相比，Fe组大鼠BW明显降低，肾重指数(KW/BW)明显升高(Plt;0.01)。与DN组相比，Fe组大鼠BW及KW差异无统计学意义(Pgt;0.05)；但KW/BW升高(Plt;0.05)。见表1。

2.2各组大鼠血糖、肾功能、UAER及铁超载比较 DN及Fe组血糖与NC组相比明显升高(Plt;0.01)；与DN组相比，Fe组大鼠的血糖也明显升高(Plt;0.01)。与NC组相比，DN组及Fe组UAER、Scr和BUN升高(Plt;0.05)；与DN组相比，Fe组UAER、Scr和BUN仍升高(Plt;0.05)。与NC组相比，DN组大鼠SI、TI和TIBC差异不具有统计学意义(Pgt;0.05)；Fe组SI和TI明显升高(Plt;0.01)，TIBC明显降低(Plt;0.01)。与DN组相比，Fe组大鼠的SI和TI升高(Plt;0.05)，TIBC明显降低(Plt;0.01)。见表2。

表1 3组大鼠BW、KW、KW/BW的比较

与NC组比较：1)Plt;0.01；与DN组比较：2)Plt;0.05

表2 3组大鼠血糖、肾功能、尿微量白蛋白排泄率及铁超载情况

与NC组相比:1)Plt;0.01，2)Plt;0.05；与DN组比较:3)Plt;0.01，4)Plt;0.05

2.3各组大鼠肾脏组织中NO、NOS和血液ET-1的变化 与NC组相比，DN组大鼠肾脏组织NO、NOS明显降低，ET-1明显升高(Plt;0.01)；与DN组相比，Fe组大鼠的NO、NOS降低(Plt;0.05)，ET-1明显升高(Plt;0.01)。见表3。

2.4各组大鼠肾组织SOD、MDA含量的变化 与NC组相比，DN组大鼠的T-SOD明显降低，MDA明显升高(Plt;0.01)；与DN组相比，Fe组大鼠的T-SOD明显降低，MDA明显升高(Plt;0.01)。见表4。

表3 3组大鼠NO、NOS及血ET-1情况

与NC组相比:1)Plt;0.01；与DN组比较:2)Plt;0.01，3)Plt;0.05

2.5各组大鼠肝脏、肾脏组织的病理改变 光镜下观察普鲁士蓝染色肝组织，可见NC组肝细胞形态规则，肝小叶轮廓清晰；DN组肝细胞脂肪变性，肝小叶结构尚完整；Fe组肝脏内可见明显的褐色铁沉积，肝细胞脂肪变性、淋巴细胞浸润、排列紊乱，肝小叶结构破坏，纤维组织增生和出血性坏死。见图1。

表4 3组大鼠T-SOD、MDA情况

与NC组相比：1)Plt;0.001；与DN组比较：2)Plt;0.01

光镜下观察HE染色肾组织，可见NC组肾小球结构正常，系膜和基质未见明显病理改变；DN组基底膜厚薄不均，系膜基质增多、肿胀；Fe组肾小球基底膜弥漫性增厚，系膜细胞增生，系膜外基质沉积，肾小管扩张，管腔变窄，上皮细胞呈空泡样变性，肾间质存在炎性细胞和淋巴细胞浸润。见图2。

图1 大鼠肝脏普鲁士蓝染色(10×10)

图2 各组大鼠的肾脏HE染色(10×10)

3 讨 论

铁是人体内含量最多的必需微量元素，人体摄入富含铁元素的食物可使机体对铁的吸收增加，但是机体缺乏有效的排泄铁的途径，久而久之机体铁超载，而铁超载对内分泌代谢、心血管、神经系统、肝脏、肾脏等系统器官产生多种影响，导致多种疾病发生及进展。DN是常见的糖尿病慢性微血管并发症之一，通常指由于糖尿病引起的肾小球基底膜增厚，系膜扩张以及胞外基质增生，导致肾小球高滤过和蛋白尿，其进展可能与炎症、凋亡、氧化应激、纤维化等主要因素有关〔8，9〕。本研究结果与之前的研究相似〔10〕，表明肾脏组织内铁沉积可以导致肾脏损伤进一步加重，铁超载对于DN的促进并不完全因为是高铁状态下血糖水平更高而导致，可能还存在其他的因素。

铁超载时过量的铁会沉积于肝脏、胰腺，引起氧化损伤，从而导致胰岛素抵抗、损害胰岛β细胞，最终促进DM的发生〔11〕，因此铁超载与胰岛素和葡萄糖代谢异常有关〔12〕。本研究结果也表明，铁超载时DM大鼠的血糖会进一步升高，而糖代谢紊乱进一步加重了DM大鼠的肾脏微血管病变。而也有研究表明铁超载后DM大鼠的血糖水平与单纯DM大鼠血糖比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)〔13〕，研究结果的不一致可能与铁负荷的剂量有关。

高血糖可通过各种炎症信号通路、iNOS等途径引起内皮细胞功能异常，而血管内皮功能受损在DN的发病过程中起到重要的作用〔3〕。NO和ET-1是一对最为重要的内皮依赖性舒血管因子和缩血管因子，NOS是NO合成过程中的关键酶，决定NO的含量。高浓度的NO是胰岛β细胞损伤的终末效应分子，也可能是导致DN早期肾小球血流动力学异常的主要介质〔14〕。当血管内皮细胞严重受损时，iNOS表达降低，NO产生减少。而DN的严重程度与ET-1水平呈正相关，选择性阻断ET受体既能阻止肾血管收缩和高滤过，又能阻止蛋白尿的进展和肾结构的破坏〔15〕。本研究结果说明铁超载促进DN进展与内皮功能障碍有关。铁超载、高血糖和高胰岛素血症具有协同作用，可同时增加ROS活性〔16〕，而iNOS和ROS的产生是DN进展的一个重要因素〔17〕，同时铁在机体内能加速脂质过氧化过程促进机体的脂质过氧化〔18〕。MDA是脂质过氧化过程中生成的一类交联性很强的具有生物毒性的醛类物质。它能够通过其碳基与膜蛋白质、核酸及磷脂等形成Schiff碱，从而导致血管壁和基底膜的增厚。MDA含量可反映体内脂质过氧化程度，也可间接反映ROS攻击并损伤细胞的程度。本研究证明铁超载促进DN的发生与发展与脂质过氧化增多有关。SOD是生物体内最重要的抗氧化酶之一，是机体清除iNOS的第一道防线。铁超载能显著提高ROS生成〔19〕，使机体处于iNOS状态造成组织损伤，进而消耗SOD。本研究的结果与此相同，显示铁超载大鼠SOD明显降低，表明机体失去了ROS的产生和清除之间的动态平衡，引起iNOS含量增强，进一步加重大鼠的肾脏病变。

1Brownlce M.The pathobiology of diabetic complications：a unifying mechanism〔J〕.Diabetes,2005；54(6)：1615-25.

2Evans JL，Goldfine ID，Maddux BA，etal.Are oxidative stress-activated singnaling pathways mediators of insulin resistance and β-cell dysfunction 〔J〕.Diabetes，2003；52(1)：1-8.

3Lorenzim A.Glucose toxicity in the vascular complications of diabetes：the cellular perspective 〔J〕.Diabetes Metab Rev，1992；8(2)：85.

4Shah S.Role of iron in progressive renal disease〔J〕.Am J Kidney Dis，2001；37(1 Suppl 2)：S30-3.

5Dobaczewski M，Chen W，Frangogiannis NG.Transforming growth factor(TGF)-βsignaling in cardiac remodeling 〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2011；51(4)：600-6.

6Zhao F，Zhang S，Shao Y，etal.Calreticulin overexpression correlates with integrin-α5 and transforming growth factor-β1 expression in the atria of patients with rheumatic valvular disease and atrial fibrillation 〔J〕.Int J Cardiol，2013；168(3)：2177-85.

7Lee TN，Albom WE，Knierman MD，etal.The diabetogenic antibiotic streptozotocin modifies the tryptic digest pattern for peptides of the enzyme O-GIcNAc-selective N-acetyl-beta-d-glucosaminidase that contain amino acid residues essential for enzymatic activity 〔J〕.Biochem Pharmaeol，2006；72(6)：710-8.

8Kelly K，Dominguez J.Rapid progression of diabetic nephropathy is linked to inflammation and episodes of acute renal failure〔J〕.Am J Nephrol，2010；32(10)：469-75.

9Kelly KJ，Liu Y，Zhang Jetal.Renal C3 complement of component；feed forward to diabetic kidney disease〔J〕.Am J Nephrol，2015；41(1)：48-56.

10Pardo-Andreu GL，Barrios MF，Curti C，etal.Protective effects of Mangifera indica L extract (Vimang)，and its major component mangiferin，on iron-induced oxidative damage to rat serum and liver〔J〕.Pharmacol Res，2008；57(1)：79-86.

11Iwasaki T，Nakajima A，Yoneda M，etal.Serum ferritin is associated with visceral fat area and subcutaneous fat area〔J〕.Diabetes Care，2005；28(10)：2486.

12Jiang R，Manson JE,Meigs JB,etal.Body Iron stores in relation to Risk of Type 2 Diabetes in Apparently Healthy Women〔J〕.JAMA，2004；11(291)：6711-7.

13Wanxia G，Xueli L，Zhonghong G，etal.Iron increases diabetes-induced kidney injury and oxidative stress in rats〔J〕.Biol Trace，2014；160(3)：368-75.

14袁 涛.1型糖尿病和B细胞凋亡〔J〕.国外医学内分泌分册，2002；22(1)：8.

15Sarafidis PA，Lasaridis AN.Diabetic nephropathy：endothelin antagonism for diabetic nephropathy 〔J〕.J Nat Rev Nephrol，2010；6(8)：447-9.

16Facchini FS，Hua NW，Reaven GM，etal.Hyperinsulinemia：the missing link among oxidative stress and age-related diseases〔J〕.Free Rad Biol Med，2000；29(12)：1302-6.

17Ha H，Kim KH.Role of oxidative stress in the development of diabetic nephropathy〔J〕.Kidney Int，1995；9(51)：S18-21.

18Benzie IF.Lipid peroxidation：a review of causes，consequences，measurement and dietary influences〔J〕.Int J Food Sci Nutr，1996；47(3)：233-41.

19Matsumoto M，Sasaki N，Tsujino T，etal.Iron restriction prevents diabetic nephropathy in Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rat〔J〕.Ren Fail，2013；35(8)：1156-62.

〔2017-07-18修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)

R587.2

A

1005-9202(2017)22-5515-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.013

内蒙古自治区教育厅基金资助项目(NJZY11205)

1 河南省确山县人民医院

张天资(1975-)，男，主任医师，主要从事眼科研究。

韩立坤(1976-)，女，主任医师，主要从事糖尿病及慢性并发症研究。