桑叶总黄酮对2型糖尿病大鼠肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体α和腺苷酸活化蛋白激酶α2蛋白表达的影响

刘冬恋 凌保东 谭 林 杨春梅 杨 霞 游均梅

(成都医学院药学院 四川省高校结构特异性小分子药物重点实验室，四川 成都 610083)

桑叶总黄酮对2型糖尿病大鼠肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体α和腺苷酸活化蛋白激酶α2蛋白表达的影响

刘冬恋 凌保东 谭 林 杨春梅 杨 霞 游均梅

(成都医学院药学院 四川省高校结构特异性小分子药物重点实验室，四川 成都 610083)

目的探讨桑叶总黄酮对2型糖尿病(T2DM)大鼠肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α2蛋白表达的影响及机制。方法建立高脂饲料喂养且用链脲佐菌素诱导T2DM雄性Wistar大鼠模型，将模型大鼠随机分为5组：模型组、二甲双胍组(100 mg/kg灌胃)、桑叶总黄酮组(200，100，50 mg/kg灌胃)，同时设立正常对照组。4 w后检测大鼠空腹血糖(FPG)、血清胰岛素(FINS)水平，Western印迹检测肝脏PPARα和AMPKα2蛋白表达。结果桑叶总黄酮能降低T2DM大鼠的FPG、FINS水平，Western印迹显示模型组大鼠肝脏PPARα和AMPKα2蛋白表达较正常对照组均明显下降(Plt;0.01)。经桑叶总黄酮干预治疗后，AMPKα2蛋白表达较模型组显著增加(Plt;0.01)，PPARα蛋白水平改变不明显(Pgt;0.05)。结论桑叶总黄酮对T2DM大鼠有一定的治疗作用，可能与其增加大鼠肝脏AMPKα2蛋白表达有关。

2型糖尿病；桑叶总黄酮；PPARα；AMPKα2

胰岛素抵抗(IR)是多种疾病如2型糖尿病(T2DM)、肥胖、高血压、高脂血症、冠心病的共同发病基础。IR是T2DM发生和发展的基本因素，贯穿于T2DM的始终，目前IR是T2DM的研究热点。桑叶是桑科桑属植物桑Morus alba L.的树叶，历代中医药书中都有桑叶能够治疗消渴的记载。现代药理研究证明桑叶具有降糖降脂的功能，可预防和治疗糖尿病。桑叶总黄酮是桑叶中降糖降脂作用的主要成分。研究显示〔1〕，桑叶总黄酮可以改善T2DM大鼠IR，缓解胰岛 β 细胞凋亡的发生，但其机制尚不明确。本研究探讨桑叶总黄酮对T2DM大鼠血糖、胰岛素水平和大鼠肝脏PPARα和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α2蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1动物和饲料 SPF级雄性Wistar大鼠85只，体重180～200 g，购自四川大学华西实验动物中心，质量合格证号：scxk(川)2009-09。在室温(22±1)℃、相对湿度(55±5)%、光照周期12 h∶12 h环境中适应饲养1 w后实验。

1.2药物 桑叶饮片购自四川省中药饮片有限责任公司，批号：130624。用25倍量体积分数为70%的乙醇浸泡1 h，超声30 min，冷凝回流1.5 h，减压回收至溶剂无醇味，然后用70%乙醇溶解，稀释，作为上柱供试液，采用聚酰胺与D-101大孔树脂联用进行精制，以80%乙醇洗脱，得到桑叶总黄酮，经紫外分光光度法测定其纯度不低于50%。

1.3主要试剂 链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司；一抗兔抗大鼠PPARα、AMPKα2多克隆抗体购自Abclonal公司；GAPDH内参抗体羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自武汉博士德公司；硝酸纤维膜购自美国Amersham公司；电化学发光(ECL)试剂购自Pierce公司；大鼠胰岛素(INS)酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒购自南京建成生物工程公司。

1.4T2DM大鼠模型的建立 85只Wistar大鼠适应性喂养1 w后，按照随机数字表法随机选取10只作为正常对照组，给予标准饲料(购自四川省医学科学院实验动物研究所)喂养，其余75只高脂饲料(按照标准饲料59.8%，白糖15%，猪油10%，食盐2%，胆固醇0.2%，酪蛋白7%，蛋黄粉5%配制)喂养，自由饮水，不应用胰岛素，保持垫料干燥，持续16 w后，将75只高脂饲料喂养的大鼠小剂量腹腔注射STZ(35 mg/kg，溶于 0.1 mol/L，pH4.4柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液中)，诱导T2DM模型。腹腔注射STZ的第3天空腹12 h后测血糖，以空腹血糖(FPG)gt;11.1 mmol/L作为造模成功标准。2 w后再测血糖，血糖值居高不下证明模型稳定，选入正式实验〔2〕。

1.5动物分组 将入选正式实验的60只高脂饲料喂养的大鼠随机分为5组，即桑叶总黄酮高(200 mg/kg)，中(100 mg/kg)，低剂量组(50 mg/kg)，二甲双胍组(100 mg/kg)，模型组，每组各12只，灌胃给药。正常对照组及模型组按10 ml/kg灌服生理盐水。给药周期为4 w。在给药期间，正常对照组给予标准饲料，其余各组大鼠给予高脂饲料。

1.6标本收集 给药4 w结束后，大鼠禁食12 h，尾静脉取血测定FPG，然后用3%戊巴比妥钠麻醉动物，心脏取血，3 000 r/min离心15 min后分离血清，分装后-80℃冰箱保存待测。取各组大鼠肝脏组织，样本用生理盐水漂洗后，滤纸吸干分装于冻存管中-80℃冰箱保存待测。

1.7血清空腹胰岛素(FINS)水平测定 采用ELISA测定，再根据以下公式计算胰岛素抵抗指数(IRI)：IRI=FPG×FINS/22.5和胰岛素敏感指数(ISI)：ISI=ln〔1/(FPG×FINS)〕〔3〕。

1.8Western印迹检测肝脏PPARα、AMPKα2蛋白表达 称取30 mg肝脏组织(剔除筋膜、脂肪等组织)，以组织重量(g)∶裂解液体积(ml)=1∶10的比例加入裂解液，同时加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)各3 μl，电动匀浆器以20 000 r/min转速匀浆，上清液测定蛋白浓度，取20 μg煮沸变性5 min。然后经10%SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜，在3%牛血清白蛋白(BSA)溶液中4℃振摇封闭30 min，洗膜后加入兔抗大鼠PPARα多克隆抗体(1∶1 000)或兔抗大鼠AMPKα2多克隆抗体(1∶1 500)4℃振摇过夜，再用辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1 h。洗膜后加ECL发光试剂，在ChemiDoc化学发光凝胶成像检测仪中进行光密度扫描。应用管家基因GAPDH作为蛋白上样量对照，其余组与其相比得到相对量。

1.9统计学方法 应用SPSS13.0软件进行单因素方差分析、LSD法。

2 结 果

2.1桑叶总黄酮对T2DM大鼠血糖和INS的影响 见表1。与正常对照组相比，T2DM造模后各组血糖水平明显升高；与模型组相比，经桑叶总黄酮干预治疗后，高、中剂量组血糖水平均明显降低(Plt;0.01)。同时，模型组血清FINS及IRI明显升高，ISI明显下降(均Plt;0.01)，说明模型组大鼠发生了IR，而给予桑叶总黄酮干预后，T2DM大鼠IR在一定程度上得到改善(Plt;0.01)。

表1 桑叶总黄酮对T2DM大鼠血糖、INS及肝脏PPARα和AMPKα2蛋白表达的影响

与正常对照组比较：1)Plt;0.01；与模型组比较：2)Plt;0.01

2.2桑叶总黄酮对T2DM大鼠肝脏PPARα和AMPKα2蛋白表达的影响 见表1，图1，图2。与正常对照组相比，模型组肝脏PPARα和AMPKα2蛋白表达均明显下降(Plt;0.01)。经桑叶总黄酮干预治疗后，AMPKα2蛋白表达较模型组显著增加(Plt;0.01)，但PPARα蛋白水平改变不明显(Pgt;0.05)。

1：正常对照组;2：模型组;3：二甲双胍组;4：桑叶总黄酮高剂量组;5：桑叶总黄酮中剂量组;6：桑叶总黄酮低剂量组，下图同图1 桑叶总黄酮对T2DM大鼠肝脏PPARα蛋白表达的影响

图2 桑叶总黄酮对T2DM大鼠肝脏AMPKα2蛋白表达的影响

3 讨 论

AMPK是一种重要的参与细胞调节代谢的应激蛋白激酶，通过感受胞质内AMP/ATP比值的变化，调节骨骼肌、肝脏、脂肪组织等多种组织细胞内的糖脂代谢。在哺乳动物体内，AMPK是由催化亚单位α和调节亚单位 β、γ 三个亚基构成的异源三聚体〔4〕。其中α亚基又包括α1和α2两个亚单位，在肝脏中α1和α2亚基的含量基本相同。在肝脏中，AMPK α亚基激活后能调节脂质代谢，抑制肝糖生成〔5〕，可能成为治疗 T2DM的组织特异性靶点。有研究显示高脂喂养可显著降低大鼠肝脏AMPKα2 mRNA水平，而对AMPKα1的影响不如AMPKα2明显，从而提示，与α1亚基相比，α2亚基与胰岛素敏感性和机体糖代谢的关系更为密切〔6〕。而AMPKα2基因敲除的大鼠，出现了体重增加，血脂异常，胰岛素敏感性下降和肝脏中甘油三酯堆积的现象〔7〕。本研究显示，经桑叶总黄酮干预治疗后，肝脏中AMPKα2蛋白表达较模型组显著增加，说明桑叶总黄酮可能通过增加肝脏AMPKα2蛋白表达而治疗T2DM。PPARα是PPARs家族的一个亚型，主要在分解代谢和糖异生活跃的器官如肝脏中有较高的表达。PPARα激活后对涉及脂肪酸摄取、结合、氧化和脂质代谢等多个基因的表达都有调节作用，对改善血脂、维持脂代谢平衡有较为显著的作用〔8〕。同时，有研究发现，PPARα激动剂能改善非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠脂质代谢紊乱，具有适度的胰岛素增敏作用〔9〕。另外，PPARα激动后能调节糖皮质激素代谢，通过减轻脂肪酸介导、胰岛素刺激的血糖在骨骼肌系统的分布而改善胰岛素敏感性。因此PPARα的激动和表达上调对T2DM患者改善血脂和IR方面起重要作用〔10〕。本研究同样证实了在T2DM大鼠模型的肝脏中，出现了PPARα蛋白表达的下调。但是桑叶总黄酮干预治疗后，PPARα蛋白表达虽有上升趋势，但无统计学差异。近年来，关于PPARα与AMPKα的关系，有一些相关研究认为，肝脏PPARα的基因转录和蛋白表达水平的增高与二甲双胍介导的肝脏AMPKα基因转录和蛋白表达水平的增高基本一致〔6〕，且AMPKα激活后可以增加PPARα的基因转录和蛋白表达水平〔11〕。但是PPARα作为调节脂肪酸氧化的一个重要调节因子，其与AMPKα之间的关系尚无一致结论。本实验显示桑叶总黄酮可以降低T2DM大鼠的FPG、FINS水平，上调AMPKα2蛋白的表达，从而对T2DM有一定的治疗作用。

1穆晓燕，李先佳.桑叶总黄酮对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2013；11(19)：213-6.

2梁海霞，白海燕，李焕德，等.高脂喂养联合低剂量链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠模型稳定性观察〔J〕.中国药理学通报，2008；24(4)：551-4.

3李光伟，潘孝仁，Lilloja S，等.检测人群胰岛素敏感性的一项新指数〔J〕.中华内科杂志，1993；32(10)：652.

4Scott JW，Ross FA，Liu JK，etal.Regulation of AMP-activated protein kinase by a pseudesubstrate sequence on the gamma subunit〔J〕.EMBO，2007；26(3)：806-15.

5Andreelli F，Foretz M，Knauf C，etal.Liver adenosine monophosphate-activated kinase-alpha2 catalytic subunit is a key target for the control of hepatic glucose production by adiponectin and leptin but not insulin〔J〕.Endocrinology，2006；147(5)：2432-41.

6王 斐.二甲双胍对高脂饲养大鼠肝脏AMPK和PPARs活性的影响〔D〕.济南：山东大学，2008.

7Jelenik T，Rossmeisl M，Kuda O，etal.AMP-activated protein kinase α2 subunit is required for the preservation of hepatic insulin sensitivity by n-3 polyunsaturated fatty acids〔J〕.Diabetes，2010；59(11)：2737-46.

8苑留云.泽泻汤对高脂血症大鼠肝组织 PPARαmRNA、ACOmRNA 基因表达的影响〔D〕.石家庄：河北医科大学，2013.

9石巧娟，刘月环，楼 琦，等.非酒精性脂肪肝大鼠PPAR-α 基因表达及脂代谢和胰岛素水平的变化〔J〕.中国比较医学杂志，2009；19(8)：26-31.

10常 庚，潘 莉，王菊素，等.补阳还五汤对2型糖尿病大鼠模型PPARα/γ表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010；30(2)：354-8.

11Guo H，Sun S，Zhang X，etal.AMPK enhances the expression of pancreatic duodenal homeobox-1 via PPARalpha，but not PPARgamma，in rat insulinoma cell line INS-1〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2010；31(8)：963-9.

〔2016-12-25修回〕

(编辑 曹梦园)

R587

A

1005-9202(2017)22-5521-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.015

四川省教育厅科研项目(No.16ZB0291)；成都医学院校基金项目(No.CYZ15-15)

刘冬恋(1983-),女，硕士，实验师，主要从事糖尿病及其并发症研究。