厄贝沙坦对帕金森病大鼠的保护作用

杨发满 黄 新 敬泽慧 蒋德旗

(青海大学附属医院老年病科，青海 西宁 810000)

厄贝沙坦对帕金森病大鼠的保护作用

杨发满 黄 新 敬泽慧 蒋德旗1

(青海大学附属医院老年病科，青海 西宁 810000)

目的探讨厄贝沙坦对鱼藤酮致帕金森病(PD)大鼠模型的保护作用。方法48只大鼠按随机数字表法分成对照组、PD模型组、PD+厄贝沙坦组、厄贝沙坦组，每组12只。2.5 mg·kg-1·d-1鱼藤酮溶于二甲基亚砜和聚乙二醇(1∶1)混合液中，埋于PD模型组、PD+厄贝沙坦组微量渗透泵中，余2组给予等质量的生理盐水；PD+厄贝沙坦组、厄贝沙坦组同时给予1 mg·kg-1·d-1厄贝沙坦每天上午8时灌胃，其余2组给予等体积生理盐水灌胃，试验周期为4 w。行为学检测评定运动功能等损害症状；高效液相检测黑质区多巴胺含量；免疫组化染色检测大鼠黑质区酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数目；Western印迹检测黑质部位α-共核蛋白、caspase-3、核因子(NF)-κB蛋白表达水平。结果与对照组比较，PD模型组体质量、多巴胺含量显著下降，黑质区TH阳性细胞数目明显减少，α-共核蛋白、caspase-3、NF-κB蛋白表达水平显著上升(Plt;0.05)；但与PD模型组比较，PD+厄贝沙坦组经厄贝沙坦干预后，体质量、多巴胺含量显著提高，TH阳性细胞数目显著增加，α-共核蛋白、caspase-3、NF-κB蛋白表达显著下调(Plt;0.05)。结论厄贝沙坦可通过提高多巴胺含量、抑制黑质区TH阳性细胞凋亡和下调α-共核蛋白、caspase-3、NF-κB蛋白表达而起到鱼藤酮致PD模型大鼠的保护作用。

帕金森病;鱼藤酮;厄贝沙坦;α-共核蛋白;多巴胺

帕金森病(PD)属于慢性神经退行性疾病，≥65岁人群发病率为1.5%〔1〕，神经元内出现α-共核蛋白(synuclein)沉积组成的路易小体，黑质区多巴胺能神经元变性、脱水等为PD主要病理特征，α-synuclein异常沉积与认知、行为失常有关，是PD早期病理关键环节。研究发现，脑组织内的肾素-血管紧张素系统(RAS)与PD发生发展密切相关，且血管紧张素(Ang)Ⅱ受体拮抗剂或管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)具有保护多巴胺能神经元的作用〔2～4〕。本研究探讨血管紧张素转换酶(AT)1受体厄贝沙坦片对鱼藤酮致PD模型大鼠的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及试剂 健康成年清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠48只，体质量250～270 g，购自甘肃中医学院动物实验中心。鱼藤酮、二甲基亚砜、酪氨酸羟化酶(TH)抗体、α-synuclein抗体购自美国Sigma公司；厄贝沙坦片，商品名：安博维，国药准字号：J20080060，法国 Sanofi Pharma Bristol-Myers Squibb SNC产品，赛诺菲(杭州)制药有限公司分装；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3抗体、核因子(NF)-κB抗体购自美国CST公司；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.2实验分组与PD模型制备 大鼠按随机数字表法分成对照组、PD模型组、PD+厄贝沙坦组及厄贝沙坦组各12只。100 g/L水合氯醛麻醉充分后，2ML4微量渗透泵(美国Alzet公司)包埋于各组大鼠背部皮下。2.5 mg·kg-1·d-1鱼藤酮溶于二甲基亚砜和聚乙二醇(1∶1)混合液中，埋于大鼠微量渗透泵中；其他3组给予等质量的生理盐水装于微量渗透泵中：PD+厄贝沙坦组同时给予1 mg·kg-1·d-1厄贝沙坦(混于0.5%甲基纤维素)，每天上午8时灌胃，对照组给予等体积生理盐水灌胃。每周一上午10时测量血压和体质量，血压测量采用无创尾动脉血压测量仪(BP-2000，美国Visitech公司)。实验设计及实施均经过青海大学附属医院动物伦理委员会的审核批准，实验操作遵循《实验动物学》有关规定。

1.3行为学评分 参照陈忻等〔5〕大鼠行为学评分标准，分为7个等级，0分：大鼠活动正常，无异常反应；1分：大鼠出现拒捕行为减弱、竖毛、毛色变黄、弓背、主动活动减少；2分：有1分的表现，且主动活动减少明显、动作迟缓或有步态不稳；4分：有2分的表现，且步态不稳，或不能直线行走或行走时向一侧旋转；6分：向单侧斜卧，单侧前肢和(或)后肢瘫痪、行走困难、近似困难；8分：单侧，前肢和(或)后肢完全瘫痪，四肢拘挛，体质量大幅度减轻，不能进食；10分：濒死状态或死亡。大鼠分组后每周进行一次评分，共持续4 w。

1.4高效液相色谱检测黑质区多巴胺含量 实验第4周末，麻醉后直接断头取脑，分离黑质脑组织，吸干表面水分称重，冰箱保存备用。待测时加0.1 mol/L高氯酸去除蛋白，制成匀浆后4℃低温10 000 r/min，离心30 min，取上清经0.22 μm滤膜过滤，即可用高效液相色谱仪(型号：LC1200，美国Agilent公司)检测。流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钠：0.02 mol/L柠檬酸钾：甲醇=72∶23∶5，λ=280 nm。参照峰值面积计算其测定值，以计算值/脑组织湿重(μg/g)表示。

1.5免疫组化染色检测TH阳性细胞 实验第4周末，麻醉后直接断头取脑，分离黑质脑组织，多聚甲醛4℃固定24 h，包埋成蜡块，进行石蜡切片，每张厚5 μm，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，滴加正常非免疫动物血清，室温下5 min，滴加1∶300稀释的兔抗TH多克隆抗体，置4℃冰箱过夜，PBS洗3次，免疫球蛋白(Ig)G-辣根过氧化物酶(HRP)(1∶500)二抗孵育，PBS洗3次，二氨基联苯胺(DAB)显色，脱水，脱敏，中性树脂胶封片，400倍显微镜下观察并计数，取平均值。

1.6Western印迹检测黑质区α-synuclein、caspase-3、NF-κB蛋白的表达 实验完成后取各组大鼠黑质脑组织，加组织裂解液超声破碎成浆液，4℃低温10 000 r/min，离心20 min，取上清低温保存，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离后，恒流转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脱脂奶粉封闭，三羟甲基氨基甲烷-吐温缓冲液(TBST)洗膜，之后加入相应的一抗(1∶1 000)、二抗(1∶5 000)进行孵育并洗膜，增强化学发光法(ECL)检测目标蛋白的表达情况。

1.7统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组行为学比较 对照组和厄贝沙坦组活动正常，毛色光滑、无异常行为；PD模型组和PD+厄贝沙坦组给药3 d后出现拘捕行为减弱，主动活动减少，毛色逐渐变黄，竖毛明显；第4周时，PD模型组2只死亡，其余10只均出现不同程度的PD症状；PD+厄贝沙坦组死亡1只，其余11只出现PD症状，但行为学评分小于PD组。见表1。

2.2各组血压、体质量、黑质多巴胺含量比较 PD模型组体质量较对照组明显减轻，PD+厄贝沙坦组减轻较PD模型组显著少(Plt;0.05)。各组间血压变化均无明显差异(Pgt;0.05)。PD模型组黑质区多巴胺含量较对照组明显低，PD+厄贝沙坦组较PD模型组明显提高(均Plt;0.05)。见表2。

2.3黑质区TH阳性细胞数目比较 PD模型组〔(21±3)个〕、PD+厄贝沙坦组TH阳性细胞数目〔(56±6)个〕较对照组〔(103±11)个〕均明显减少(Plt;0.05)，PD+厄贝沙坦组TH阳性细胞数目较PD模型组显著增加(Plt;0.05)，厄贝沙坦组TH阳性细胞数目〔(98±10)个〕较对照组变化不显著(Pgt;0.05)。见图1。

2.4Western印迹检测各组黑质区α-synuclein、caspase-3、NF-κB的蛋白表达 与对照组比较，PD模型组α-synuclein、caspase-3、NF-κB 3种蛋白表达水平显著提高(Plt;0.05)；PD+厄贝沙坦组干预后，α-synuclein、caspase-3、NF-κB蛋白表达均较PD模型组显著下调(Plt;0.05)。见表3、图2。

表1 各组4 w后行为学评分比较(n=12，n)

表2 厄贝沙坦对大鼠体质量、血压及黑质区多巴胺含量的影响

与对照组比较:1)Plt;0.05，与PD模型组比较：2)Plt;0.05，下表同

图1 各组黑质区TH阳性表达(DAB，×400)

组别nα-synucleincaspase-3NF-κB对照组121.0±0.21.0±0.11.0±0.2PD模型组102.1±0.51)3.1±0.71)2.2±0.41)PD+厄贝沙坦组111.6±0.32)1.2±0.22)1.1±0.32)厄贝沙坦组121.1±0.20.9±0.21.2±0.2

图2 Western印迹检测各组α-synuclein、caspase-3、NF-κB表达

3 讨 论

RAS存在于大脑多个器官组织，在PD等神经退行性疾病发生发展中发挥作用〔6〕。纹状体中存在ATⅡ、ATⅡ受体及AT，ACEI或AT1受体拮抗剂在6-羟基多巴胺(OHDA)和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)致PD动物模型中保护多巴胺能神经元〔3,4〕。厄贝沙坦属于AngⅡ受体抑制剂，能抑制AngⅠ转化为AngⅡ，能特异性地拮抗AT1受体，抑制血管收缩和醛固酮的释放，产生降压作用。研究表明，厄贝沙坦可降低酒精性脑损伤大鼠血清及脑组织神经元特异性烯醇化酶水平，有望成为治疗酒精性脑损伤患者的预防用药〔7〕。厄贝沙坦可有效改善大脑中动脉阻断(MCAO)大鼠脑损伤的作用〔8〕。阿司匹林联合厄贝沙坦治疗急性脑梗死的临床疗效确切，安全性较高，可有效改善血液流变学、减轻炎性反应、提高神经功能及生活质量〔9〕。厄贝沙坦通过上调糖尿病大鼠肾组织基质金属蛋白酶(MMP)-9、下调NF-κB及MMP抑制剂(TIMP)-1的表达，达到减缓糖尿病肾病的发生发展〔10,11〕。白藜芦醇联合厄贝沙坦抑制大鼠肺纤维化及肺组织转化生长因子(TGF)-β1、NF-κB表达，对博莱霉素诱导大鼠肺纤维化具有明显的改善作用〔12〕。厄贝沙坦抑制糖尿病肾病大鼠肾脏内质网应激相关的C/EBP同源蛋白-氨基末端激酶(CHOP-JNK)-caspase-12凋亡途径、减少细胞凋亡、保护肾脏功能〔13〕。本研究结果显示，厄贝沙坦也可通过下调NF-κB，caspase-3的表达，增加大脑黑质区多巴胺含量和TH阳性细胞数目起到保护多巴胺能神经元的作用。厄贝沙坦可能通过抑制心肌组织中TGF-β1表达，进而减少骨膜蛋白(periostin)表达水平实现抗病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纤维化的作用〔14〕。厄贝沙坦拮抗高糖环境中胰岛细胞凋亡，可能与抑制AT1R、AngⅡ mRNA表达，阻断RAS通路及抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶介导的氧化应激有关〔15〕。厄贝沙坦可降低高血压小鼠血管组织前纤维蛋白(Profilin)-1表达及转录激活因子(STAT)3磷酸化水平，促使血管氧化应激水平改善，降低血压〔16〕。厄贝沙坦下调糖尿病大鼠心肌组织TGF-β1和结缔组织生长因子的表达，从而抑制糖尿病心肌纤维化，改善心功能〔17〕。

综上所述，厄贝沙坦对鱼藤酮所致PD模型大鼠具有保护作用：①改善鱼藤酮所致的PD大鼠行为学变化；②增加大鼠黑质区多巴胺含量及TH阳性细胞数目；③抑制凋亡相关蛋白NF-κB，caspase-3的表达；④减少α-synuclein的表达与沉积。

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〔2016-06-04修回〕

(编辑 苑云杰/王一涵)

R742.5

A

1005-9202(2017)22-5533-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.020

广西自然科学基金资助项目(No.2016GXNSFBA380040)

1 玉林师范学院生物与制药学院

蒋德旗(1986-)，男，讲师，博士，主要从事神经药理研究。

杨发满(1963-)，男，主任医师，主要从事老年血液病学研究。