不同剂量阿托伐他汀钙对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脊髓内核转录因子-κB表达及白细胞介素-2、-10水平的影响

张瑞彪 罗永伟 石秋艳

(河北联合大学附属曹妃甸区医院神经内分泌科，河北 唐山 063200)

不同剂量阿托伐他汀钙对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脊髓内核转录因子-κB表达及白细胞介素-2、-10水平的影响

张瑞彪 罗永伟1石秋艳2

(河北联合大学附属曹妃甸区医院神经内分泌科，河北 唐山 063200)

目的观察实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE) 大鼠不同发病阶段脊髓内核转录因子(NF)-κB表达及血清白细胞介素(IL)-2、IL-10的水平变化及不同剂量阿托伐他汀钙对其影响。方法以50%豚鼠全脊髓匀浆诱导Wistar大鼠EAE致病模型，采用量化评分法，比较不同剂量阿托伐他汀钙对 EAE大鼠脊髓中 NF-κB表达及对血清IL-2、IL-10的影响。结果高剂量阿托伐他汀钙可降低血清IL-2水平，升高IL-10水平，下调NF-κB 在脊髓中的表达(Plt;0.05)，延长EAE大鼠发病的潜伏期，降低EAE大鼠神经功能评分。结论高剂量阿托伐他汀钙能显著改善EAE大鼠病情程度及调节血清IL-2、IL-10水平。

阿托伐他汀钙；自身免疫性脑脊髓炎；核转录因子-κB；白细胞介素-2；白细胞介素-10

多发性硬化(MS)是人类中枢神经系统内自身免疫性炎性脱髓鞘性疾病，其主要病理过程表现为自体免疫反应导致的神经轴突损伤及神经纤维髓鞘脱失等〔1〕。本文探讨不同剂量阿托伐他汀钙对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠脊髓内核转录因子(NF)-κB表达及血清白细胞介素(IL)-2、IL-10水平。

1 材料与方法

1.1实验材料 雌性Wistar大鼠58只，6～8 w，体重160～200 g，健康，清洁级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。豚鼠8只，雌雄各半，350～390 g，购自温州医科大学实验动物中心，健康，清洁级。

1.2模型动物制备方法 我们按照徐玉等〔2〕方法制备豚鼠全脊髓匀浆，予10%水合氯醛4 ml注射于豚鼠腹腔内，麻醉成功后处死，立即冰上剥离脊膜，取出脊髓，按1 g脊髓+1 ml生理盐水比例配比后，用超声细胞粉碎仪制成50%全脊髓匀浆，加入等量含4%卡介苗的完全福氏佐剂充分混合至油包水乳剂，乳化后按0.5 ml/只4 h内注射于大鼠四足垫内皮下，诱发建立大鼠EAE模型。

1.3药物及试剂 阿托伐他汀钙由大连辉瑞制药有限公司提供。IL-2、IL-10试剂盒购自上海天呈生物技术有限公司。兔抗大鼠NF-κB 抗体及二步免疫组化检测试剂盒由北京博奥森生物技术公司提供。完全福氏佐剂由美国 Sigma 公司提供；卡介苗购自北京生物制品研究所。

1.4实验动物分组 从58只Wistar大鼠中随机抽取 10只作为正常对照组，其余经过造模成功后随机分成3组，即EAE组、低剂量组、高剂量组，每组16只，按照时间顺序再分成2个亚组，即14 d组和21 d 组，每亚组8只。免疫后当日高剂量组予阿托伐他汀钙8 mg/kg，于每日清晨8点灌胃治疗1次。低剂量组予2.5 mg/kg阿托伐他汀钙每日清晨8点灌胃治疗，每日 1 次。EAE组及正常对照组均于同时间段予温开水灌胃，直至动物处死。

1.5神经症状评分及造模成功标准 大鼠EAE模型评分法采用较为通用的5分评分法：1分：大鼠尾巴无力下垂；2分：双后肢轻度无力；3分：严重后肢麻痹；4分：四肢瘫痪；5分：濒死状态或死亡。造模成功标准：神经症状评分≥1分。

1.6病理标本制作 各组大鼠造模成功及相应治疗后第14、21天分别处死。10%水合氯醛5 ml腹腔注射，麻醉成功后断头处死，迅速完整剥离脊髓，石蜡封片包埋，按照每25 μm 间断性连续切片后行常规HE染色。

1.7血清IL-2、IL-10及NF-κB阳性细胞的测定 大鼠处死后立即采心血2 ml，3 000 r/min离心后获取血清，-70℃冰箱保存。血清IL-2、IL-10的测定采用双抗夹心酶联免疫吸附法。试剂盒购自上海天呈生物技术有限公司，由实验室工作人员严格按照试剂盒说明进行测定。NF-κB阳性细胞采用免疫组化法检测，由实验室专业人员严格按照试剂盒说明操作，同时设阴性对照。取大鼠脊髓切片在显微镜下计数每张片内随机5个高倍视野(×400)NF-κB阳性细胞数，NF-κB的表达以该片阳性细胞数总和/5表示，取10片平均值作统计学处理。

1.8统计学方法 采用SPSS14.0软件进行χ2及LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组神经症状评分及死亡情况 正常对照组大鼠各时间段均无发病及死亡情况发生。其余各组7～13 d发病，部分大鼠症状呈进展性加重，少数病情缓解后复发，部分大鼠死亡。高剂量组病情明显轻于低剂量组及EAE组，同日神经功能评分明显低于上述两组，发病率及死亡率亦明显低于上述两组，见表1。

2.2各组血清炎症因子及NF-κB 标记的阳性细胞 发病后14 d EAE组血清IL-2水平明显高于正常对照组，发病21 d较14 d时有所降低，其中两个时间段高剂量组均低于低剂量组及EAE组，而IL-10则呈反方向变化，EAE组及低剂量组发病14～21 d均低于正常对照组，而高剂量组则明显升高，高于上述三组。NF-κB 阳性细胞数量于14 d后明显增多，到21 d阳性细胞数又逐渐减少，两个时间段均高于正常对照组(Plt;0.05)。高剂量组大鼠在免疫后14、21 d，NF-κB 阳性细胞数明显低于EAE组及低剂量组(Plt;0.05)。见表2。

表1 各组EAE发病情况及病情评分

与正常对照组比较：1)Plt;0.05；与EAE组及低剂量组比较：2)Plt;0.05，下表同

表2 各组不同时间段血清炎症因子水平及NF-κB表达情况

3 讨 论

MS是一种自身免疫性炎性脱髓鞘性疾病，多种细胞因子及自由基在其疾病发展过程中起着重要作用，有研究报道，自由基清除剂依达拉奉能有效缓解MS症状〔3〕。研究发现CD4+Th1细胞在EAE发病过程中起到了主要的介导作用〔4〕。CD4+细胞分为Th1和Th2两个亚型。两个亚型分别分泌不同炎症因子，在整个炎症反应中扮演不同角色。Th1型细胞因子如IL-2、IL-12、肿瘤坏死因子(TNF)-α等，能激活巨噬细胞，介导炎症反应的发生及进展，导致并促进神经髓鞘的损伤，对神经系统脱髓鞘病变的产生起着极为重要作用；Th2型细胞介导的细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10等，可以抑制Th1型细胞因子，并通过下调血管内皮细胞和巨噬细胞的应急状态参与炎症反应的修复，对神经纤维脱髓鞘起到保护作用〔5〕。因此，Th1/Th2之间的动态平衡是机体免疫平衡、自身防御、内环境稳定的重要机制。已有研究表明MS患者及EAE模型中存在Th1/Th2型细胞因子的失衡，维持Th1/Th2型细胞因子的动态平衡已成为研究MS发病及临床转归的新策略之一，同时NF-κB通路是参与上述炎症因子调控的重要信号系统，在EAE免疫调节和炎症发展中具有重要作用〔6〕。他汀类药物是目前临床的最常用的一类调脂药物，而阿托伐他汀作为最有效的他汀类调脂药物之一，不仅可以稳定动脉硬化斑块，且可有效地降低血超敏C反应蛋白等炎症因子〔7〕。他汀类药可以减少白细胞向中枢神经系统的移动，同时调节T细胞和B细胞的趋化因子和黏附因子，减少诱导T细胞激活的黏附分子的表达，下调T细胞和 B细胞趋化因子的受体〔8〕，其抗炎症机制可能是通过抑制EAE大鼠Th1细胞，阻断类异戊二烯中间代谢产物的生成，进而减少干扰素(IFN)和TNF-α的水平，从而维持Th1/Th2的动态平衡〔9〕。王淑歌等〔10〕研究显示阿托伐他汀可对EAE大鼠产生影响。

本实验提示高剂量阿托伐他汀钙具有免疫双向调节作用，可能通过抑制NF-κB 阳性细胞增殖活化过程，从而减轻神经系统内炎症反应，因此利于EAE的恢复。林述凯等〔11，12〕也有研究证明，阿托伐他汀可促进中枢神经系统内的星形胶质细胞的增生，从而生成多种抗炎症因子，这些抗炎症因子能有效减低神经髓鞘的损伤，可有效减轻发病症状，有利于 EAE 的恢复。

1郝海光，李红艳，张晓丹，等.独活治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的免疫学机制研究〔J〕.时珍国医国药，2012；23(10)：2407-10.

2徐 玉，刘瑞春，王 颖，等.Wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的建立〔J〕.脑与神经疾病杂志，2007；15(6)：415-8.

3梁江红，陈 琳.依达拉奉对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的保护作用〔J〕.现代诊断与治疗,2012；23(8)：1116-7.

4朱振国，王新施，陈艳艳，等.3种大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的差异〔J〕.医学研究杂志，2013；42(2)：34-7.

5厉 芳，郑荣远，张正学，等.阿米洛利对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢神经系统中细胞因子表达的影响〔J〕.中国临床神经科学，2012；20(2)：121-5.

6侯绍蔚，刘岳婷，郭敏芳.盐酸法舒地尔治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的潜能与抗炎作用〔J〕.中国临床神经科学，2012；29(2)：126-34.

7刘 威，吕 娟，刘荣丽，等.阿托伐他汀对脑梗死并发颈动脉粥样硬化斑块及C反应蛋白的影响〔J〕.中国实用神经疾病杂志，2014；17(12)：42-3.

8田广平，石秋艳，王淑歌.阿托伐他汀对EAE大鼠脊髓ICAM-1和TGF-β1表达的影响〔J〕.中华神经医学杂志，2011；10(10)：979-82.

9Mizrachi K，Aricha R，Feferman T，etal.Involvement of phosphodiesterases in autoimmune diseases〔J〕.J Neuroimmunol，2010；220(1-2)：43-51.

10王淑歌，林述凯，石秋艳，等.阿托伐他汀对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的影响〔J〕.安徽医科大学学报，2011；46(10)：997-1000.

11林述凯，石秋艳，王淑歌，等.阿托伐他汀对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脊髓内NF-κB表达的影响〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2011；37(4)：607-11.

12石秋艳，张瑞彪，田广平.不同剂量阿托伐他汀钙对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脊髓内NF-κB表达及血清炎性因子的影响〔J〕.疑难病杂志，2014；13(1)：70-3.

〔2016-08-03修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R744.3

A

1005-9202(2017)22-5562-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.033

1 河北联合大学附属医院病案室 2 河北联合大学神经重症科

张瑞彪(1973-)，男，主治医师，医学硕士，主要从事慢性炎症反应与神经内科疾病相关性研究。