microRNA-21在非小细胞肺癌患者体内外周血和癌组织中的表达水平及其通过调节PTEN蛋白参与抑癌的机制

张轩斌 彭 飞

(南阳市中心医院呼吸内科二病区,河南 南阳 473000)

microRNA-21在非小细胞肺癌患者体内外周血和癌组织中的表达水平及其通过调节PTEN蛋白参与抑癌的机制

张轩斌 彭 飞

(南阳市中心医院呼吸内科二病区,河南 南阳 473000)

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血清和癌组织中microRNA-21表达水平及其对肺癌细胞的侵袭和增殖影响。方法32例NSCLC患者为研究组，30例同期肺部良性病变患者为对照组，采用Real-time RCR检测研究组肿瘤组织、癌旁组织及两组血清中microRNA-21的表达水平；此外，对肺癌细胞株A549转染microRNA-21的抑制物(inhibitor)或模拟物(mimics)后，采用transwell及CCK-8法观察microRNA-21对肺癌细胞株的侵袭及增殖的变化，并采用Western印迹检测A549中张力蛋白同源基因(PTEN)蛋白水平。结果研究组血清及肿瘤组织中microRNA-21的表达水平显著高于对照组及癌旁组织(均Plt;0.05)；A549转染microRNA-21 mimics后细胞的侵袭和增殖能力显著增加(Plt;0.05)，转染microRNA-21 inhibitor后，细胞的侵袭和增殖能力显著降低(Plt;0.05)，而PTEN蛋白转染后，表达水平与上述结果相反。结论NSCLC患者肿瘤组织和血清中高表达的microRNA-21可能通过抑制PTEN蛋白参与癌细胞侵袭和增殖能力的调节。

microRNA-21；非小细胞肺癌(NSCLC)；增殖；侵袭；张力蛋白同源基因(PTEN)

microRNA(miRNA)的异常表达在多种疾病，尤其是肿瘤的发病、诊断和预后中均发挥重要的作用〔1，2〕。microRNA-21能促进胶质母细胞瘤的细胞存活和侵袭，在卵巢癌患者血清中表达增加，并且与肿瘤的分级显著相关，抑制肿瘤的生存〔3〕。研究发现，在卵巢癌上皮细胞中，microRNA-21通过调节张力蛋白同源基因(PTEN)的表达参与调节肿瘤细胞的生长和侵袭〔4〕。肺癌是目前世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，致死率高、预后差，其中，约4/5为非小细胞肺癌(NSCLC)〔5〕。miRNA-21的编码基因定位于17q23.2，即液泡膜蛋白基因(VMP1)的第十内含子，且在子宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌及大肠癌等标本组织中都检测出miRNA-21表达水平异常升高，提示其可作为一个致癌性小RNA〔6〕。本文研究miRNA-21在NSCLC患者体内的表达情况及其对病情发生发展的影响。

1 材料与方法

1.1临床资料 选择2012年1月至2014年12月在南阳市中心医院进行根治性切除术的NSCLC患者32例为研究组，手术标本经细胞学及病理学确诊，未发现肿瘤远处转移，剔除术前经介入或放、化疗治疗者，合并其他慢性病如高血压、糖尿病或其他肿瘤等患者。男18例，女14例，年龄31～76〔平均(41.5±9.2)〕岁。对照组为同期治疗肺部良性病变患者30例。其中男17例，女13例，年龄31～75〔平均(48.1±11.3)〕岁。其中结核5例，炎性假瘤13例，肺囊肿12例。两组性别、年龄差异无统计学意义(Pgt;0.05)，具有可比性。留取两组外周血3 ml，静置5～6 h后，离心取上清；术中取研究组肺癌组织及对应癌旁组织，-80℃冻存待测。

1.2细胞培养 人肺癌细胞A549(美国ATCC公司)，生长于DMEM培养基中〔含10%胎牛血清(FBS)，10×104U/L青霉素，100 mg/L链霉素〕，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育培养。

1.3细胞转染 采用脂质体LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)，按照LipofectamineTM2000产品说明书操作，将microRNA-21 inhibitor或mimics(上海吉玛公司)转染至A549细胞中，以磷酸盐缓冲液(PBS)为空白对照，microRNA-21-NC作为阴性对照，转染48 h后，检测转染效率。

1.4Real-time PCR检测血清或组织中miRNA-21表达水平 取各组外周血清、肿瘤组织、癌旁组织及转染miRNA-21抑制物(inhibitor)或模型物(mimics)的A549细胞，加入1 ml Trizol(美国Gibco公司)抽提RNA，并依照Real-time PCR试剂盒(美国ROCHE公司)产品说明书，检测miRNA 21的表达水平(以U6作为内参)。定量PCR扩增仪(7900，美国ABI公司)检测miRNA-21表达水平，采用2-ΔΔCt方法表示microRNA-21的相对表达量。引物：miRNA-21，正义：5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3′，反义：5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′。

1.5Western印迹检测A549细胞中PTEN蛋白表达水平 收集转染48 h后的肺癌A549细胞，加入RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)，抽提细胞全蛋白；二喹啉甲酸(BCA)法测定细胞总蛋白浓度，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白后，湿转法将蛋白转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉室温震荡封闭1 h，Tris盐酸缓冲液(TBS-T)洗涤后，分别加入1∶2 000 抗PTEN抗体，1∶100抗β-actin抗体(均购自美国abcam公司)，4℃孵育过夜，TBS-T洗涤，10 min/次，洗涤3次，加入1：2000辣根过氧化物酶(HRP)的羊抗兔二抗(美国SantaCruz公司)，室温孵育1 h后，TBS-T 洗涤，10 min/次，洗涤3次，化学发光并曝光成像，观察PTEN蛋白表达变化。

1.6细胞迁移实验 取转染后人肺癌A549细胞5×104个，接种至transwell小室上层(24孔板悬挂式，美国Millipore公司)，小室下层加入800 μl的含有10% FBS的DMEM培养液。24 h后，去除24孔板下室中的培养液，棉签擦去Transwell小室内室膜上的细胞，0.1%结晶紫溶液染色，室温5 min，显微镜(日本Olympus公司)下观察并进行细胞计数(随机选取3个视野)。

1.7细胞增殖实验 取对数生长期A549细胞接种至96孔板中，每孔0.8×104个细胞，每组设置4个平行复孔，以不含细胞的空白培养基作为阴性对照，24、48、72 h后，每孔加入10 μl八肽胆囊收缩素(CCK-8)试剂(美国sigma)后，培养箱中孵育4 h，酶标仪(Elx800，美国BioTek公司)检测450 nm处的吸光度值(OD)。

1.8统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1两组外周血血清中miRNA-21表达水平比较 与对照组(1.08±0.33)比较，研究组(5.22±12.49)血清miRNA-21的表达水平显著增加(t=9.028，P=0.000)；miRNA-21在肺癌患者肿瘤组织中表达水平(11.03±4.12)显著高于癌旁组织(1.13±0.32；t=13.118，P=0.000)

2.2肺癌细胞中miRNA-21对细胞增殖的影响 A549转染miRNA-21 mimics后，miRNA-21水平(2.28±0.16)及癌细胞的OD值显著高于对照组(0.98±0.04)和空白组(1.06±0.07)(Plt;0.05)；而A549肺癌细胞转染miRNA-21 inhibitor后，miRNA-21表达水平(0.28±0.17)及癌细胞的OD值明显低于对照组和空白组(Plt;0.05)。见图1。

2.3肺癌细胞中miRNA-21对细胞侵袭的影响 同对照组、空白组5个视野的细胞数(33.20±2.70，32.70±3.64)相比，A549肺癌细胞转染miRNA-21 mimics后，癌细胞的侵袭能力(56.53±2.32)显著增加(Plt;0.05)；而A549肺癌细胞转染mi-croRNA-21 inhibitor，癌细胞的侵袭能力(19.60±2.17)显著降低(Plt;0.05)。见图2。

图1 各组A549细胞中miR-21 mRNA增殖水平(×400)

2.4肺癌细胞高低表达miRNA-21后PTEN蛋白表达水平比较 与对照组(1.04±0.15)相比，转染miRNA-21 mimics细胞中PTEN蛋白表达水平(0.24±0.02)显著降低(Plt;0.05)；转染microRNA-21 inhibitor细胞中PTEN蛋白表达水平(2.25±0.31)显著增加(Plt;0.05)。空白组为1.01±0.19。见图3。

图2 各组A549细胞侵袭能力(×400)

图3 各组A549细胞中PTEN蛋白表达水平

3 讨 论

研究发现，肺癌的发病率及死亡率占所有类型恶性肿瘤的20%～25%〔7〕。肺癌中往往以NSCLC最为多见，占肺癌发病人群的4/5左右〔9〕。研究认为，NSCLC从发生、发展到最终的死亡是一个复杂的生物学过程，涉及众多因素参与其中〔8〕。miRNA-21具有高度的组织特异性、时序性和保守性〔9〕。当miRNA-21异常表达时，与多种肿瘤的发病及预后关系密切，是重要的肿瘤“癌基因”调节因子，对肿瘤的诊断及预后具有重要作用〔10〕。本研究结果提示miRNA-21的异常表达与NSCLC的发生有关。研究发现在前列腺癌细胞中的miRNA-21表达水平增加，并认为miRNA-21是重要的肿瘤抑制分子〔11〕。 肿瘤细胞的侵袭和增殖能力影响肿瘤的发展和转归〔12，13〕。本研究结果表明，肺癌患者体内异常表达的miRNA-21可能直接影响肺癌细胞的增殖和侵袭能力。Yang等〔14〕在胶质瘤患者体内及胶质瘤细胞系中发现miRNA-21均高表达，且miRNA-21表达水平与患者的生存密切相关。PTEN基因也被称为TEP1〔15〕。该基因由9个外显子组成，编码由403个氨基酸组成的蛋白质，具有磷酸酯酶的活性功能。研究表明，PTEN蛋白可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性参与肿瘤的发生发展的抑制〔16〕。研究发现，在肝癌细胞中高表达的miRNA-21能够直接通过靶向PTEN基因增加肿瘤细胞的增殖和侵袭〔17〕。本研究结果提示miRNA-21可通过靶向调节PTEN蛋白的表达参与肺癌细胞的增殖和侵袭过程，其可能作为NSCLC新靶点的诊断和治疗的潜在分子。

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〔2017-05-27修回〕

(编辑 滕欣航)

R735.2

A

1005-9202(2017)22-5571-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.037

张轩斌(1981-)，男，硕士，主治医师，主要从事肺癌及呼吸重症相关研究。