亚抑菌浓度环丙沙星对大肠埃希菌喹诺酮类耐药质粒接合转移的影响

鄂顺梅，龙一飞，曾建明，鲁洋，陈茶

(广州中医药大学第二附属医院，广州510006)

亚抑菌浓度环丙沙星对大肠埃希菌喹诺酮类耐药质粒接合转移的影响

鄂顺梅，龙一飞，曾建明，鲁洋，陈茶

(广州中医药大学第二附属医院，广州510006)

目的探讨亚抑菌浓度环丙沙星对大肠埃希菌喹诺酮类耐药质粒接合转移的影响。方法采用PCR法筛选含有质粒介导的喹诺酮类耐药基因[包括qnrA、qnrB、qnrC、aac(6′)-Ib-c基因]的大肠埃希菌作为供体菌；质粒接合试验分析喹诺酮类耐药质粒的接合转移能力；不同亚抑菌浓度的环丙沙星处理供体菌后，观察喹诺酮类耐药质粒接合效率的改变。结果16株供体菌携带质粒介导的喹诺酮类耐药基因，其中6株供体菌携带的喹诺酮类耐药质粒可以接合转移，接合效率为2.6×10-2～1.2×10-1；接合效率最高的1株供体菌经不同亚抑菌浓度的环丙沙星处理后，其接合效率最高可较无环丙沙星处理组增加1.5倍。结论亚抑菌浓度的环丙沙星可以促进大肠埃希菌喹诺酮类耐药质粒的接合转移。

细菌耐药；质粒介导的喹诺酮耐药；耐药质粒接合转移；大肠埃希菌; 环丙沙星; 抗生素亚抑菌浓度

大肠埃希菌(E.coli)是院内感染和交叉感染的主要致病菌之一。抗生素的不合理应用使E.coli的耐药问题日趋严重[1，2]。作为一种广谱高效的抗生素，喹诺酮类抗生素广泛用于治疗E.coli引起的感染，然而近几年E.coli对喹诺酮类药物的耐药率逐年上升，局部地区耐药率高达70%[3]。E.coli对喹诺酮类抗生素的耐药机制复杂多样，其中质粒介导的喹诺酮类耐药(PMQR)[4]，因其可通过细菌间基因水平转移(HGT)而使耐药基因在细菌间水平传播，导致院内感染大范围流行而备受关注。随着抗生素使用的增加，细菌对其抗性也随之增加，反之亦然。这种情况不仅限于E.coli等革兰阴性杆菌，革兰阳性球菌亦是如此，如在减少红霉素的使用以后，A类链球菌抗生素耐药株的数量减少[5]。若抗生素是导致细菌耐药性增强的原因，那么可否将这一现象解释为“抗生素对HGT有一定的促进作用”呢？基于接合反应对HGT具有重要的促进作用[6,7]，我们推测抗生素能通过促进细菌接合反应而加速耐药基因在细菌间的转移[8]。通常抗生素对细菌的作用具有浓度和时间依赖性，为达到抑制甚至杀灭细菌的作用，临床应用抗生素时需根据药物代谢动力学参数定时定量给药，以维持抗生素的浓度大于其最小抑菌浓度(MIC)[10]。然而，实际上有多种因素导致到达感染部位的抗生素仅达到“亚抑菌浓度，即亚MIC”(sub-MIC)而杀灭不了细菌。sub-MIC的抗生素可导致细菌发生一系列的反应，如促进接合反应[10]。为此，2016年6～12月，我们就不同sub-MIC的环丙沙星对E.coli的喹诺酮类耐药质粒接合效率的影响进行了观察。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株 广州中医药大学第二附属医院2015年1～12月分离的E.coli菌株，其中包括环丙沙星耐药或中介菌株60株、环丙沙星敏感菌株15株，共75株，无重复菌株；75株E.coli菌株采用VITEK2全自动细菌鉴定系统鉴定，-70 ℃保存。对叠氮化钠耐药的E.coli J53AZr菌株由上海复旦大学王明贵教授馈赠。

1.2 主要试剂 革兰阴性细菌鉴定卡、革兰阴性细菌药敏卡、VITEK2全自动微生物分析系统为法国生物梅里埃公司产品；PCR试剂盒、DNA Marker DL 2000为大连宝生物公司产品；抗生素标准品氨苄西林和环丙沙星购自广东省药品检验所及中国食品药品检定研究院。

1.3 E.coli菌株PMQR基因和接合相关基因的检测 采用PCR技术。将75株E.coli菌株在血平板上分离出单个菌落。采用煮沸法提取75株E.coli的DNA，按菌株分离的时间先后顺序对75株细菌进行编号(1～75号)。目的基因引物序列见表1(其中qnrA、qnrB，qnrS引物来自文献[11]，aac(6′)-Ib-cr、traI、traG引物采用Primer Premier 5.0引物设计软件设计)。采用多重PCR对qnrA、qnrB、qnrS进行扩增，反应体系和反应条件参照文献[11]。所有PCR产物经测序验证，并与GenBank数据库提供的基因序列进行比对以确定其基因型。

1.4 环丙沙星的MIC值测定 采用微量肉汤法。参照CLSI M07-A9进行环丙沙星的MIC值测定。用倍比稀释法稀释环丙沙星，设置阴性对照孔与无抗生素对照孔，将100 μL稀释后的环丙沙星药液加入96孔聚苯乙烯板中。将新鲜复苏的2～3个含有PMQR基因的E.coli菌株的单个菌落接种于3 mL 的LB营养肉汤中并培养至指数生长期，调浊度至0.5麦氏单位(约含细菌1×108CFU/mL)。将0.5麦氏浊度的菌液稀释20倍，然后向已加入环丙沙星药液的96孔聚苯乙烯板每孔中加入10 μL(5×104CFU/孔)稀释后的菌液，35 ℃孵育18～20 h，判读结果。

表1 目的基因引物序列(5′-3′)

1.5 PMQR质粒接合转移实验 采用液体接合法。①能够接合转移的E.coli菌株的筛选：用含有PMQR基因的E.coli菌株(PMQR阳性菌株)作为供体菌，E.coli J53Azr菌株作为受体菌进行接合试验，筛选能够接合转移的PMQR阳性菌株。具体过程如下：挑取PMQR阳性菌株和E.coli J53Azr菌株的单个菌落接种于LB营养肉汤，分别培养至对数生长期。取96孔板，每孔加入100 μL的LB营养肉汤，取1×106CFU供体菌和等量的受体菌接种于100 μL的LB营养肉汤中接合2 h。取30 μL上述接合后菌液，1∶50稀释后取30 μL涂布于含有50 μg/mL氨苄西林和50 μg/mL叠氮化钠的LB琼脂平板上，35℃培养24 h，计数接合子数目并计算接合效率:接合效率=接合子菌落数/供体菌菌落数[12]。②sub-MIC的环丙沙星对接合反应的影响：采用倍比稀释法配制不同sub-MIC的环丙沙星溶液(环丙沙星浓度分别为1/16、1/32、1/64、1/128、1/256的MIC，同时设不加环丙沙星的对照组)，按照一定量加入3 mL的LB营养肉汤中，将3×106CFU的接合效率最高的PMQR阳性菌株接种于上述培养基中，35 ℃培养至指数生长期，吸取1 mL菌液，4 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL的 LB营养肉汤。然后按照上述方法与E.coli J53Azr菌株进行接合试验。

1.6 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计量资料比较用配对t检验。Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E.coli菌株PMQR基因的检测结果 从75株E.coli中分离到16株含有PMQR基因aac(6′)-Ib-cr、qnrB、qnrS的菌株(判为PMQR阳性菌株)，没有分离到含有qnrA基因的菌株。16株PMQR阳性菌株均对氨苄西林耐药，除43号菌株对环丙沙星敏感外，其余15株均对环丙沙星耐药。16株PMQR阳性菌株的耐药基因分布情况及氨苄西林和环丙沙星的MIC见表2。

表2 PMQR阳性菌株的耐药基因分布及氨苄西林和环丙沙星的MIC(μg/mL)

注：环丙沙星的MIC值≤1 μg/mL为敏感、≥4 μg/mL为耐药；氨苄西林的MIC值≤8 μg/mL为敏感、≥32 μg/mL为耐药。

2.2 PMQR阳性菌株与受体菌的质粒接合转移试验结果 16株PMQR阳性菌株中，只有11、22、28、43、58号PMQR阳性菌株的质粒能够接合转移，与受体菌E.coli J53Azr的接合效率分别为2.6×10-2、3.2×10-2、9.2×10-2、8.1×10-2、1.2×10-1。58号菌株接合效率最高，在接合18 h后就可见接合子长出，其他菌株需要36 h才见接合子，所有单独供体菌或受体菌在含有氨苄西林和叠氮化钠的筛选板上培养48 h未见菌落生长。在11、22、28、43、58号菌株中可以检测到接合基因traI和traG(见图1)，而在其他PMQR阳性菌株中未检测到上述两种接合基因。

2.3 sub-MIC的环丙沙星对58号菌株中的喹诺酮类耐药质粒接合转移的影响 喹诺酮类耐药质粒接合效率最高的58号E.coli菌株，分别经1/16、1/32、1/64、1/128、1/256 MIC的环丙沙星处理后，其与受体菌E.coli J53Azr的接合效率分别为0.12±0.02、0.15±0.04、0.18±0.05、0.21±0.06、0.27±0.07，未加环丙沙星的58号E.coli菌株与受体菌E.coli J53Azr的接合效率为0.10±0.02。与未加环丙沙星的菌株的接合效率相比，加入不同sub-MIC的环丙沙星菌株的接合效率均升高，其中加入1/256 MIC的环丙沙星菌株的接合效率升高1.5倍(Plt;0.05)。

注：A为traG接合基因在PMQR阳性菌株中的表达；B为traI接合基因在PMQR阳性菌株中的表达。

图1接合基因traI和traG在PMQR阳性菌株中的检测结果

3 讨论

质粒介导的耐药是新发现的一类喹诺酮类抗生素耐药机制，该类质粒具有广泛的宿主，它可以通过接合的方式转移到E.coli、肺炎克雷伯菌、伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌等细菌中，即通过HGT使耐药基因在细菌间水平传播。在E.coli中PMQR基因主要有qnr基因(包括qnrA、qnrB、qnrS等)、氨基糖苷乙酰转移酶的变异基因aac(6′)-Ib-cr和喹诺酮外排蛋白基因(QepA或OqxAB)。Qnr等PMQR基因的单独存在可以使菌株对喹诺酮药物的敏感性降低，但可能并未达到具有临床意义的喹诺酮耐药水平或仅仅导致低水平的喹诺酮耐药，不过含qnr等PMQR基因的菌株在长期大量使用喹诺酮药物时更容易发生染色体突变，或者含染色体突变的菌株在适宜的条件下可以捕获qnr基因，在这两种情况下菌株同时具有了质粒和染色体介导的喹诺酮耐药机制，引起高水平喹诺酮耐药[13]。因此，质粒介导的耐药成为导致喹诺酮高水平耐药的重要途径[14]。

本研究在75株E.coli菌株中发现16株(21.3%)可检出PMQR基因(qnrB，qnrC，aac(6′)-Ib-c)，其中12株检出aac(6′)-Ib-cr、8株检出qnrS、5株检出qnrB，未检出qnrA。Aac(6′)-Ib序列trp102arg和asp179tyr这两个氨基酸突变后就成为喹诺酮耐药基因aac(6′)-Ib-cr，经测序证实所扩增的片段均为aac(6′)-Ib-cr。本研究目的就是筛选含有PMQR基因的菌株作为后续接合实验的供体菌，因此尽可能选择喹诺酮耐药菌株为研究对象。

Qnr基因主要存在于Ⅰ类整合子中，并与其他多种耐药基因如β内酰胺酶共存于同一质粒而导致细菌对多种抗生素耐药。含有aac(6′)-Ib-cr的菌株通常也与β内酰胺酶基因共存。本研究筛选的16株PMQR阳性E.coli菌株均对氨苄西林耐药，而受体菌E.coli J53Azr对叠氮化钠耐药、对氨苄西林敏感，因此实验选用氨苄西林和叠氮化钠筛选接合子。16株PMQR阳性株中只有11、22、28、43、58号菌株的质粒可以接合转移，同时在这些能够接合转移的分离株中可以检测到traI和traG接合基因。traI编码松弛酶，启动接合反应；traG编码先导蛋白，使切开的单链向受体菌转移。其他不能接合的PMQR阳性菌株中未检测到上述两种基因。这一结果提示接合反应的发生与接合基因的表达密不可分。

sub-MIC的抗生素不能抑制细菌增殖，却可以改变细菌的物理化学性质[15]。低浓度的抗生素(环丙沙星，红霉素，β-内酰胺类)可以增加E.coli、金黄色葡萄球菌不同衍生物或大肠杆菌与金黄色葡萄球菌之间的耐药性质粒的转移频率[16]。而许多其他抗生素，包括万古霉素和替考拉宁则没有这样的效果。在本研究中，我们发现接合效率最高的58号菌株经不同sub-MIC的环丙沙星处理，再与E.coli J53Azr接合，其接合效率明显升高，sub-MIC越小，接合效率越高，到1/256 MIC时接合效率增高约1.5倍。因此，我们认为sub-MIC浓度的环丙沙星可以促进喹诺酮耐药质粒的接合转移，但具体机制需要进一步研究确认。

抗生素的不充分使用通过促进多种耐药基因的转移而有助于增加细菌耐药性，希望可以找到有效的预防措施来抵抗耐药基因的接合转移。喹诺酮通常以浓度依赖性方式杀死病原体，对于该类药物的使用，维持药物浓度高于MIC的时间长度对于根除细菌是至关重要的。

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Effectofsub-minimuminhibitoryconcentrationofciprofloxacinonconjugativetransferofquinolone-resistantplasmidofEscherichiacoli

EShunmei,LONGYifei,ZENGJianming,LUYang,CHENCha

(TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

ObjectiveTo investigate the effect of sub-minimum inhibitory concentration of ciprofloxacin on the conjugative transfer of quinolone-resistant plasmid of Escherichia coli.MethodsQnrA, qnrB, qnrC, aac(6′)-Ib-c genes were confirmed by PCR and DNA sequencing. The transferability of the plasmids harboring PMQR genes was investigated by conjugation test, so as to screen transferable Escherichia coli as donor. The effect of ciprofloxacin on conjugative transfer of drug resistant plasmids was observed after treatment with Escherichia coli with sub-MIC of ciprofloxacin.ResultsThere were 16 strains of Escherichia coli which were detected the target genes. Among 16 strains of positive bacteria, the PMQR gene of the 6 strains was able to conjugative transfer, and the conjugative efficiency was between 2.6×10-2and 1.2×10-1. The conjugative efficiency of the 1 strain with the highest transfer efficiency could be up to 1.5 times when treated with different concentrations of ciprofloxacin.ConclusionThe sub-minimum inhibitory concentration of ciprofloxacin can promote the conjugative transfer of quinolone-resistant plasmids.

antibiotic resistance of bacteria; plasmid-mediated quinolone resistance； conjugation transfer of resistant plasmid; Escherichia coli; ciprofloxacin; antibiotic sub-minimum inhibitory concentration

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.008

R378

A

1002-266X(2017)43-0025-04

广东省公益研究与能力建设专项基金资助项目(2014A020212281)；广州中医药大学拔尖人才科研专项基金资助项目(2014KT1491)。

鄂顺梅(1978- )，女，硕士，副主任技师，主要研究方向为细菌耐药机制。E-mail: sanhesi@163.com

陈茶(1970- )，男，硕士，教授，主要研究方向为细菌耐药机制。E-mail: chencha906@163.com

2017-07-26)