八味龙钻颗粒对佐剂性关节炎大鼠的影响

罗宇东++吴玉强+++庞宇舟++谭安蔷+米阿娜

[摘要] 目的 研究八味龍钻颗粒对佐剂性关节炎大鼠的影响。 方法 将60只大鼠随机分为空白对照组、模型组、雷公藤多苷片组和八味龙钻颗粒低、中、高剂量组，除空白对照组外，其余各组均按每只0.1 mL弗氏完全佐剂（FCA）注射于大鼠左后足跖内。实验第8天开始灌胃给药，每日1次，给药体积10 mL/kg，八味龙钻颗粒剂量为5.9、11.8、23.6 g/kg，雷公藤多苷片为0.009 45 g/kg，空白对照组及模型组予等体积蒸馏水，连续灌胃给药21 d。观察佐剂性关节炎模型大鼠踝关节肿胀度及病理改变情况，并采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测大鼠血清及关节组织匀浆中白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。 结果 与空白对照组比较，造模8 d起模型组及各给药组大鼠足趾厚度显著增加，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）；与模型组比较，造模29 d八味龙钻颗粒高剂量组足趾肿胀度明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；病理检测显示，八味龙钻颗粒高剂量组滑膜细胞增生程度、炎症细胞浸润程度均减轻；八味龙钻颗粒各剂量组血清IL-1β、TNF-α含量与模型组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 八味龙钻颗粒能降低佐剂性关节炎大鼠的足趾肿胀度，减轻滑膜细胞增生及炎症细胞浸润，对大鼠佐剂性关节炎病理模型具有一定的改善作用。

[关键词] 八味龙钻颗粒；类风湿关节炎；佐剂性关节炎

[中图分类号] R322.72 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）11（c）-0026-05

Effects of Bawei Longzuan Granules in rats with adjuvant arthritis

LUO Yudong1，2 WU Yuqiang1 PANG Yuzhou2，3 TAN Anqiang1 MI A'na3

1.Pharmaceutical Factory， Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530023， China； 2.Key Laboratory of Zhuang Medicine Prescriptions Basis and Application Research of Guangxi Colleges and Universities， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China； 3.College of Zhuang Medicine， Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China

[Abstract] Objective To study the effects of Bawei Longzuan Granules in rats with adjuvant arthritis. Methods Sixty SD rats were randomly divided into blank control group， model group， Tripterygium Wilfordii Tablets group， and low， medium， high dose of Bawei Longzuan Granules group. Except for blank control group， the other groups were only given 0.1 mL of Freund complete adjuvant （FCA） injection into the left-hind feet of each rat. At the eighth day of the experiment， intragastric administration was started， once a day， the dosing volume was 10 mL/kg， the dosages of Bawei Longzuan Granules were 5.9， 11.8， 23.6 g/kg， the dosage of Tripterygium Wilfordii Tablets was 0.009 45 g/kg， blank control group and model group were given same volume of distilled water， continuous intragastric administration for 21 days. The conditions of ankle joint swelling and pathologic changes in model rats with adjuvant arthritis were observed， and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the contents of interleukin-1β （IL-1β）， tumor necrosis factor α （TNF-α） in serum and joint tissue homogenate of rats. Results Compared with blank control group， started from the eighth day of making model， the feet thickness of model group and all medication groups was increased， the differences were statistically significant （P < 0.01 or P < 0.05）； compared with model group， the swelling degree of toes in high dose of Bawei Longzuan Granules group at the 29th day of modeling was decreased， the difference was statistically significant （P < 0.05）； the pathological examination showed that the proliferative degree of synovial cells and the invasive degree of inflammatory cells in high dose of Bawei Longzuan Granules group were all reduced； there were no statistically significant differences of the contents of serum IL-1β， TNF-α in each dose of Bawei Longzuan Granules group compared with those of model group （P > 0.05）. Conclusion Bawei Longzuan Granules can decrease the swelling degree of toes in rats with adjuvant arthritis， reduce the proliferation of synovial cells and inflammatory cell infiltration， which has certain improving effects for the pathological model of rats with adjuvant arthritis.endprint

[Key words] Bawei Longzuan Granules； Rheumatoid arthritis； Adjuvant arthritis

类风湿关节炎（RA）是一种常见慢性病及疑难疾病，严重危害人类健康；RA的治疗有多种，包括外科手术、理疗、替代疗法等，但以药物治疗为主，使用的药物包括免疫抑制剂、调节性抗类风湿药、非甾体类抗炎药、肾上腺皮质激素等；目前临床上使用的各种抗风湿药物仅能减轻症状，不能根本阻止疾病的发展，并伴随较强的毒副作用。因此，寻求研发高效低毒的抗RA新药物、新技术是极为重要而紧迫的任务，而祖国传统医药及少数民族医药，特别是广西壮医药在防治RA上具有较大的潜力优势与鲜明特色。壮药八味龙钻颗粒是广西中医药大学制药厂与广西中医药大学拟联合研发的国家六类新药，其处方为壮医药专家庞宇舟教授在挖掘总结壮医治疗活动期RA的传统药物的基础上，按照壮医理论配伍组方的经验方，临床治疗活动期RA效果显著。项目组前期已开展了产品的生产工艺、质量标准、临床试验及部分药理毒理学研究[13-21]，本研究拟采用文献方法[22-26]，研究八味龙钻颗粒对佐剂性关节炎大鼠模型的影响，旨在為产品的后续开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，雄性，3月龄，体重180～200 g，合格证号：SCXK桂2014-0002，分笼饲养，由广西医科大学实验动物中心提供，饲养于20～25℃、相对湿度（60±10）%的环境中，颗粒饲料喂养，自由饮水。

1.2 药物与试剂

八味龙钻颗粒干膏粉（批号：20140501），由广西中医药大学制药厂提供，棕褐色，每克干膏粉含生药9.266 g，人口服推荐用量为每人（成人）每日101 g生药，成人体重按60 kg计算，折合剂量为1.68 g/kg；雷公藤多苷片（湖南千金协力药业有限公司，批号：20140601）；醋酸地塞米松片（天津天药药业股份有限公司，批号：1401283）。上述药品试验时以蒸馏水配成所需浓度使用。弗氏完全佐剂（FCA），Sigma公司产品。大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒均购自北京方程生物科技有限公司，其他试剂为分析纯。

1.3 仪器

BS224S型电子天平（北京赛多利斯）；SM-3自动化酶免分析仪（北京天石医疗用品制作所）。

1.4 模型制备

大鼠佐剂性关节炎模型的制备：临用前从冰箱中取出FCA，充分振荡、混匀。大鼠常规消毒后将其左肢拉直，用1 mL注射器针头于足跖中部皮内注射，每只大鼠注射0.1 mL FCA。造模后除空白对照组外，其余组均出现大鼠足趾多发性炎性反应（足趾及关节出现肿大，足跖明显增厚、动作迟缓、活动障碍）为造模成功。

1.5 动物分组及给药

将60只SD雄性大鼠按体重随机分为空白对照组、模型组、雷公藤多苷片组和八味龙钻颗粒低、中、高剂量组。其中除空白对照组外，其余各组均按每只0.1 mL FCA注射于大鼠左后足跖内。实验第8天开始灌胃给药，每日1次，给药体积10 mL/kg，八味龙钻方剂量为5.9、11.8、23.6 g/kg，雷公藤多苷片为0.009 45 g/kg，空白对照组及模型组给予等体积蒸馏水，连续灌胃给药21 d。

1.6 观察指标

1.6.1 一般情况 造模及给药前后称重，仔细观察大鼠体毛色泽、精神状态、四肢活动及体重变化。

1.6.2 足趾厚度测定 造模前将大鼠左后肢拉直，用记号笔在大鼠足跖处作上标记，然后用游标卡尺测量左后足跖的厚度并记录。给大鼠注射FCA为造模第1天，造模第8、15、22、29天（即每隔7 d）测量大鼠左后足跖厚度并记录（每天上午10：00测量），并根据左后足跖给予FCA前后的厚度之差计算肿胀度（cm）。

1.6.3 血清IL-1β、TNF-α含量测定 末次给药后1 h，以3.5%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血分离血清，采用ELISA法测定大鼠血清及关节组织匀浆中IL-1β、TNF-α含量。

1.6.4 病理学检测 处死大鼠，立即分离后肢致炎侧病变关节，去皮后10%甲醛固定，EDTA脱钙，乙醇逐级脱水，常规石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色（HE法），进行组织学评价。观察关节滑膜被覆上皮有无细胞变性、增生，间质有无炎症细胞浸润及肉芽组织形成；关节腔有无减小或闭塞，关节软骨有无破坏或纤维化；关节周围皮下组织有无炎细胞浸润或纤维化。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用One-way ANOVA比较多组间均值差异，两组间显著差异用q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

造模后，模型组大鼠左后足关节红肿明显并逐日加重，足跖明显增厚、动作迟缓、活动障碍；雷公藤组大鼠的毛色、活力等状况优于模型组。体重方面，与空白对照组比较，造模15 d起，模型组大鼠体重显著降低，造模22 d起，八味龙钻颗粒各剂量组和雷公藤多苷片组大鼠体重亦明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；与模型组比较，造模29 d，八味龙钻颗粒高剂量组与雷公藤多苷片组大鼠体重明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠足趾厚度的比较

与空白对照组比较，造模8 d起模型组及各给药组大鼠足趾厚度显著增加，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）；与模型组比较，造模29 d八味龙钻颗粒高剂量组与雷公藤多苷片组给药后足趾厚度降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。endprint

2.3 各组大鼠足趾肿胀度的比较

与模型组比较，造模29 d八味龙钻颗粒高剂量组足趾肿胀度明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

2.4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β含量比较

与空白对照组比较，模型组、八味龙钻颗粒各剂量组、雷公藤多苷片组TNF-α及IL-1β含量明显升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；八味龙钻颗粒各剂量组血清TNF-α、IL-1β含量与模型组比较差异无统计学意义（P > 0.05），提示八味龙钻颗粒对血清TNF-α及IL-1β含量没有影响作用。见表4。

2.5 病理检测

镜下显示：空白对照组关节软骨和骨组织结构正常，无滑膜细胞增生，无炎症细胞浸润。模型组滑膜细胞增生明显，排列紊乱，滑膜内有大量炎症细胞浸润。八味龙钻颗粒高剂量组滑膜细胞增生程度减轻，炎症细胞浸润程度减轻。雷公藤多苷片组、八味龙钻颗粒低、中剂量组滑膜细胞增生仍较明显，有较多炎症细胞浸润。见图1。

A.空白对照组；B.模型组；C.雷公藤多苷片组；D.八味龙钻颗粒低剂量组；E.八味龙钻颗粒中剂量组；F.八味龙钻颗粒高剂量组

（HE染色，100×）

3 讨论

RA是一种以慢性、进行性、侵袭性关节炎为主要表现的全身性自身免疫病，随着发病率的不断升高，急需开发有效低毒的抗风湿药物。壮医药治疗RA具有特色优势，壮医理论把毒作為最主要致病原因，认为毒之所以能致病：一是毒邪损伤正气，正不胜邪，影响三气同步而发病；二是某些毒邪在体内阻滞“三道”（谷道、水道、气道）、“两路”（龙路、火路），使三气不能同步而致病。毒虚致病论奠定了壮医病因病机理论的基础。壮医称风湿病为 “发旺”，又称为风湿骨痛、风手风脚，是指人体虚弱，邪毒（风毒、湿毒、寒毒、痧毒、热毒等）乘虚而入，客于筋骨，阻滞三道（谷道、水道、气道）两路（龙路、火路），使天地人三气不能同步而致病。广西地处亚热带，气候多雨潮湿，是风湿病多发地区。壮族先民通过长期的实践，积累了丰富的风湿病验方。本研究拟研发的八味龙钻颗粒处方由飞龙掌血（温肖）、大钻（勾钻洪）、青风藤（勾容抢）等壮药材组成，能疏通龙路、火路之瘀滞，直接祛邪外出，恢复天、人、地三气的同步运行，从而达到通调龙路火路、补虚祛毒、祛风除湿、通痹止痛之功，用于发旺（风湿骨痛、类风湿性关节炎）等症，长期临床验证此方在预防、治疗RA和改善RA患者生活质量方面具有显著效果（有效率达85%），副作用小。本研究治疗RA的药效学研究采用大鼠佐剂性关节炎模型，是一种免疫制剂刺激形成的免疫亢进性关节炎症，与人RA的形成及表现有类似之处，试验表明，八味龙钻颗粒高剂量组对佐剂性关节炎大鼠体重增长缓慢有改善作用，也能降低佐剂性关节炎大鼠的足趾肿胀度，减轻滑膜细胞增生及炎症细胞浸润程度，这也许是临床上该药治疗RA的药理学基础。

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（收稿日期：2017-04-24 本文编辑：张瑜杰）endprint