高效液相色谱法用于甘遂半夏汤中6种成分的含量测定

李文静+洪博++刘军+张杰+徐天娇+王玉春

[摘要] 目的 建立同时测定甘遂半夏汤中尿嘧啶核苷、肌苷、鸟嘌呤核苷、芍药内脂苷、甘草苷、芹糖甘草苷6种化学成分含量的方法，为甘遂半夏汤的质量控制提供一定理论依据。 方法 安捷伦（Agilent）TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；柱温：30℃；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：乙腈-水溶液梯度洗脱；进样量：20 μL。 结果 各对照品在线性范围内线性关系良好，相关系数均≥0.9995；加样回收率为98.1%～101.2%，RSD≤3.3%。 结论 本法操作简单、快速、准确，重现性好，可为甘遂半夏汤的质量控制的制订奠定基础。

[关键词] 高效液相色谱；甘遂半夏汤；含量测定；质量控制

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）11（c）-0130-04

Determination the contents of six compounds in Gansuibanxia Decoctions by high performance liquid chromatography

LI Wenjing HONG Bo LIU Jun ZHANG Jie XU Tianjiao WANG Yuchun

School of Pharmacy， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Province， Qiqihar 161006， China

[Abstract] Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of six compounds （uridine， carnine， guanosine， albiflorin， liquiritin， liquiritin apioside） in Gansuibanxia Decoctions， in order to provide a theoretical basis for the quality control of Gansuibanxia Decoction. Methods The Agilent TC-C18 column （4.6 mm×250 mm×5 μm） was used at 30℃ with acetonitrile-water （gradient elution） as the mobile phase； the detective wavelength was 254 nm； the flow rate was 1.0 mL/min； the injection volume was 20 μL. Results Every standards showed a good linear relationship in the linear range， the correlation coefficients were all more than 0.9995. The recoveries were in the range of 98.1%-101.2%. RSDs were all less than 3.3%. Conclusion The method established in this paper is simple and fast with good accuracy and repeatability. It may lay the foundation for the quality control of Gansuibanxia Decoctions.

[Key words] HPLC； Gansuibanxia Decoctions； Determination； Quality control

甘遂半夏湯始载于张仲景《金匮要略·痰饮咳嗽病脉证并治》的方药，方剂由甘遂、半夏、芍药、甘草4味中药组成，主治留饮欲去而不能尽除之症，由于本方作用峻猛，因此限制了其临床应用的范围，临床多用于治疗肝癌、肺心病腹水、小儿哮喘等[1-4]。甘遂，有毒，其峻下逐水力峻[5-6]。半夏，有燥湿化痰、降逆止呕的功效[7-9]。芍药，具有散瘀止痛、活血化瘀的功效[10-12]。甘草能缓解峻烈药物的毒性[13-15]。中药汤剂是一个复杂的混合物体系，需要釆用不同的先进分析技术，从不同的角度对中药的质量进行评价。甘遂半夏汤的质量标准在国内外的研究较少，多见有临床应用的报道文献[16-18]。尿嘧啶核苷、肌苷、鸟嘌呤核苷、芍药内脂苷、甘草苷、芹糖甘草苷是甘遂半夏汤中重要的活性成分[19-21]。本文首次采用反相高效液相色谱（HPLC）程序洗脱法对甘遂半夏汤中此6种化学成分含量进行同时测定，可以充实甘遂半夏汤的药对理论及实验研究，为其临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-1000D型液相色谱仪（山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司）；DG160型中药粉碎机（浙江省瑞安市春海药材器械厂）；JY1002多功能电子天平（上海衡平仪器仪表厂）；JRT1型调温电热套（辽阳博大科学仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

甲醇、乙腈均为色谱纯（美国Fisher试剂公司），水为三重蒸馏水，尿嘧啶核苷（20160324）、肌苷（20161127）、鸟嘌呤核苷（20160116）、芍药内脂苷（20151224）、甘草苷（20151109）、芹糖甘草苷（20160612）均购于中国食品药品检定研究院。甘遂、半夏、芍药和甘草药材购于齐齐哈尔新特药有限公司，经齐齐哈尔医学院药学院中药教研室郭丽娜教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液制备 分别精密称取尿嘧啶核苷、次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、芍药内酯苷、甘草苷、芹糖甘草苷对照品适量置于100 mL量瓶中，加甲醇适量、溶解并稀释至刻度，制得浓度分别为160.4、30.80、156.3、28.30、602.5、66.40 μg/mL的对照品贮备液。依次精密量取上述对照品贮备液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分别置于5个10 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容，摇匀，制得系列对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取样品粉末3.3 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密称定，加水40 mL，称定重量，回流提取2 h，放置室温，再称定重量，加水补足减失的重量，经0.22 μm微孔滤膜过滤制得供试品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：安捷伦（Agilent）TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱：0～15 min 3%乙腈；15～25 min 3%～5%乙腈；25～35 min 5%～10%乙腈；35～40 min 10%～25%乙腈；40～55 min 25%～35%乙腈；55～60 min 35%～25%乙腈；60～65 min 25%～10%乙腈；65～67 min 10%～3%乙腈；67～70 min 3%乙腈；流速：1 mL/min；柱温：室温；进样量：20 μL；紫外检测波长为254 nm。在上述条件进样测定，色谱图见图1，待测组分的分离度良好，与其他成分無干扰。

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线与线性范围 取“2.1.1”项下系列对照品溶液，按上述色谱条件进样测定，记录各对照品峰面积，以各成分浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得尿嘧啶核苷的回归方程：Y=3.31×105X-76205（r=0.9988）；肌苷的回归方程：Y=9.20×105X-15163（r=0.9976）；鸟嘌呤核苷的回归方程：Y=1.06×105X+60458（r=0.9996）；芍药内脂苷的回归方程：Y=3.23×105X-12533 （r=0.9994）；甘草苷的回归方程：Y=9.20×105X-23592.4（r=0.9973）；芹糖甘草苷的回归方程：Y=1.12×106X+86948.17（r=0.9987）。结果表明尿嘧啶核苷、肌苷、鸟嘌呤核苷、芍药内脂苷、甘草苷、芹糖甘草苷分别在1.604～32.080 μg/mL，0.308～6.180 μg/mL，1.563～31.26 μg/mL，0.283～5.660 μg/mL，6.025～120.500 μg/mL，0.664～13.280 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 取中浓度点的混合对照品溶液，按照上述色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积，计算峰面积的RSD值。结果尿嘧啶核苷、肌苷、鸟嘌呤核苷、甘草苷、芍药内脂苷、芹糖甘草苷峰面积的RSD值分别为1.05%、1.56%、1.17%、1.92%、1.67%和1.25%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 按上述供试品的制备方法，制备一份样品，分别于室温下0、2、4、6、8、12 h进样测定，记录各待测成分的峰面积，计算峰面积的RSD值。结果尿嘧啶核苷峰面积的RSD为1.40%，肌苷峰面积的RSD为1.86%，鸟嘌呤核苷峰面积的RSD为1.53%，芍药内脂苷峰面积的RSD为0.68%，甘草苷峰面积的RSD为1.27%，芹糖甘草苷峰面积的RSD为0.43%，结果表明样品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 按上述供试品的制备方法，平行制备6份样品，依法测定，记录峰面积，根据峰面积和取样量计算样品中成分的含量，以6份含量的RSD来表示重复性。尿嘧啶核苷含量的RSD为1.02%，肌苷含量的RSD为0.98%，鸟嘌呤核苷含量的RSD为1.15%，芍药内脂苷含量的RSD为1.45%，甘草苷含量的RSD为1.24%，芹糖甘草苷含量的RSD为1.29%，结果表明重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取样品约1.65 g，分别置于6个圆底烧瓶中，分别按照已知量的100%加入对照品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法测定，计算待测成分的加样回收率和RSD，结果见表1。尿嘧啶核苷、肌苷、鸟嘌呤核苷、芍药内脂苷、甘草苷、芹糖甘草苷6个成分回收率的RSD分别为1.20%、2.39%、1.80%、2.50%、2.50%、2.50%。

2.4 样品含量的测定

按上述供试品溶液制备方法平行制备3份供试品溶液，按照上述色谱条件测定，记录峰面积，由得到的数据及各主要成分的回归曲线计算含量。见表2。

3 讨论

3.1 分析方法的建立

中药汤剂的化学成分复杂，含量微少，一般的分析仪器与方法难以对复方中药成分进行分离和检测。本实验建立的高效液相色谱法首次同时测定了甘遂半夏汤中6种有效成分的含量，方法简便、灵敏度高、重复性好，便于推广。并且对不同比例与组成的流动相、柱温、检测波长、流速等因素予以考察，选择分离度较高、基线平整的色谱条件。

3.2 色谱条件最终的确定

笔者在前期实验过程中已经尽力摸索，因为前3个色谱峰尿嘧啶核苷、次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷与后面3个色谱峰芍药内酯苷、甘草苷和芹糖甘草苷极性相差较大，进行同时测定的时候溶剂梯度跨度较大，易引起基线的不稳，导致上浮；而后3个色谱峰的极性又很相似，摸索了很多条件，很难达到基线分离，所以直至最终实验条件的确定，笔者认为本文的色谱条件是用该仪器能同时测定甘遂半夏汤中6个待测成分的最佳分离条件。而且本文的积分都是设定好色谱仪参数进行的自动积分，消除了手动积分的误差，同时通过方法学考察可以看出本研究建立的方法准确、可行。

3.3 结论

本研究建立的HPLC-UV方法能同时分离测定甘遂半夏汤中的尿嘧啶核苷、肌苷、鸟嘌呤核苷、芍药内脂苷、甘草苷、芹糖甘草苷6个成分的含量，方法简单、可靠、易重复，测定时间短且无杂质干扰，可用于甘遂半夏汤的质量控制研究。

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（收稿日期：2017-08-15 本文编辑：程 铭）