人催乳素受体蛋白在肛周脓肿患者中的表达及其与预后的关系

陶勇 杨关根 裘建明 徐侃 王东 汪鸿涛

人催乳素受体蛋白在肛周脓肿患者中的表达及其与预后的关系

陶勇 杨关根 裘建明 徐侃 王东 汪鸿涛

目的 探讨人催乳素受体蛋白在肛周脓肿组织中的表达及其与临床病理特征的关系，预测可能作为肛周脓肿预后的一个生物标志物。方法 收集2015年08月至2016年08月杭州市第三人民医院肛肠外科收治的肛周脓肿行手术切排并经病理证实的60例患者的肛管黏膜组织标本（肛周脓肿组）及临床资料。另取年龄、性别、体重相匹配的8例单纯痔病患者的肛管黏膜组织标本作为对照（对照组）。运用免疫组织化学（免疫组化）和Western blot方法检测两组标本中催乳素受体蛋白表达水平，并结合临床病理资料进行统计分析。同时采用单因素及多因素Logistic回归分析探讨组织中PRLR表达水平与肛周脓肿预后的相关性。结果 免疫组化结果显示，PRLR蛋白阳性的棕色颗粒主要弥漫性分布在细胞膜中，部分可见于细胞质。其中在脓肿组肛管黏膜中低表达率为68.33%（41/60）及高表达率31.67%（19/60），与对照痔病组PRLR蛋白高表达相比，差异具有统计学意义（χ2=5.701，p＜0.05）；同时Western Blot结果显示PRLR蛋白在脓肿组中的表达灰度比值（0.515±0.067）明显低于对照组灰度比值（0.836±0.035）（t=3.14，p＜0.01）；全组患者未愈为34例，占56.67%。其中PRLR低表达与高表达，分别为79.41%（27/41）和20.59%（7/19）。单因素及多因素分析显示，脓肿性质（OR=7.911，95% CI：1.115~20.161，P=0.039）、脓肿切口（OR=3.246，95%CI：0.774~5.742，P=0.042）及 PRLR 低表达量（OR=9.099，95%CI：1.727~14.426，P=0.016）是肛周脓肿患者预后不良的独立危险因素（均p＜0.05）。结论 PRLR蛋白在肛周脓肿患者肛管黏膜组织中表达显著降低，同时低表达的PRLR对判断手术后肛周脓肿患者预后具有较好的参考价值。

肛管； 预后； 催乳素受体； 肛周脓肿

肛周脓肿是肛肠外科常见病，每年新发病例逐渐上升，多见于年轻男性，急性发作时往往表现为局部红肿热痛，严重影响青壮年的生活质量［1］。目前，多认为系经典的肛腺感染学说，关于其发病分子机制鲜有新的探索［2］。因此，进一步研究肛周脓肿形成的相关分子病理机制，寻找有助于临床治疗的指标或新靶点，是目前研究的热点与难点。催乳素受体（prolactin receptor，PRLR），是由位于人第五号染色体的短臂（5p13-14）基因表达的产物，属于Ⅰ型细胞因子受体超家族，与激素及细胞因子等信号传递密切相关［3］。近来研究发现，PRLR在多种炎性疾病组织中高表达，提示其可影响局部组织免疫微环境，在参与刺激免疫细胞增殖及产生炎性细胞因子机制中可能起到重要作用［4-6］。本研究采用免疫组织化学（免疫组化）和免疫印迹（Western blot）方法同时检测肛周脓肿患者的脓肿壁组织和脓肿旁组织中PRLR蛋白的表达，结合患者的临床资料，旨在分析人肛周脓肿壁组织PRLR蛋白的表达以及与临床病理机制的关系。

资料与方法

一、 研究对象

肛周脓肿患者入选标准：（1）初次确诊肛周脓肿［1］，且未经任何治疗；（2）排除其他感染性疾病比如炎症性肠炎、肛管炎等；（3）排除合并严重的心肺肝肾疾病及溶血性疾病等。根据以上标准，收集2015年08月至2016年08月杭州市第三人民医院肛肠外科收治的60例肛周脓肿行手术切排并经病理证实的肛管黏膜组织标本（肛周脓肿组）及临床资料；其中男34例，女26例，年龄21~55（35.0±7.4）岁。另取年龄、性别、体重相匹配的8例单纯痔病患者的肛管黏膜组织标本作为对照（对照组）。

二、 标本收集

分别取每例患者术中标本的肛管黏膜组织，其中肛周脓肿患者组织命名为A、单纯痔病患者组织命名为B，各2份；一份放入液氮中保存，另一份经4%多聚甲醛固定后行石蜡包埋。本研究标本的收集均经医院伦理委员会通过，患者或其家属签署知情同意书。

三、 实验仪器与试剂

鼠抗人PRLR多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）、鼠抗人α-tubulin多克隆抗体（美国ABclonal公司）、生物素化山羊抗鼠抗体（美国cell signal 公司）、免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒（购于武汉博士德生物工程有限公司）

四、 研究方法

1.免疫组织化学染色（LP方法）：（1）对肛周脓肿及单纯痔病患者肛管黏膜组织标本经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚5 um，经常规脱蜡水化，枸橼酸缓冲液高温修复抗原，PBS漂洗3次后以0.3%过氧化物氢-甲醇孵育10 min，清除内源性的过氧化物酶活性，PBS漂洗4次后滴加5% BSA封闭液，室温孵育60 min，倾去，滴加1：100鼠抗人PRLR多克隆抗体，4 ℃冰箱孵育过夜，PBS漂洗3次后，再滴加二抗，室温孵育20 min，PBS漂洗4次，DAB显色，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，PBS代替一抗作阴性对照；（2）结果判断：阴性为无染色或小于等于5%细胞胞质染色；阳性为细胞质内棕黄色颗粒（弱阳性：淡棕色胞质染色或小于25%细胞棕黄色染色；强阳性：大于或等于25%细胞胞质棕黄色）。

2.Western blot 检测：从60例配对的肛周脓肿患者中采用随机数表法随机抽取挑出8例患者及全部的8例单纯痔病患者，并均从标本库中取出相应的冻存组织，用细胞蛋白裂解液提取D0和D5组织的总蛋白，测定蛋白浓度。配制分离及浓缩胶的丙烯酰胺溶液。电泳分离蛋白后湿转法冰浴环境转移至PVDF膜。转移后的PVDF用5% TBSA脱脂奶粉室温封闭1 h，然后加入鼠抗人PRLR多克隆抗体（1:1 000）室温孵育1 h。洗膜后加入生物素化山羊抗鼠抗体（1:5 000）孵育1 h。洗膜后滴加ECL试剂室温孵育2~5 min，在暗房中曝光，显影定影后胶片保存摄片，扫描保存为电脑文件。每例样品均分别进行3次检测，image J灰度分析软件将3次独立实验的Western blot 结果图片上每个特异条带灰度值数字化，其中PRLR表达水平以PRLR和α-tubulin灰度比值表示。

五、 随访方法

随访由专门的随访小组通过电话、信函及复诊的方式完成。疗效判定标准：（1）痊愈：症状消失，脓肿腔和创面愈合；（2）未愈：治疗后局部创面未愈，或存在局部脓腔，演变为肛瘘；或者肛周脓肿已经治愈。但在原部位复发。随访3月终止。

六、 统计学分析

采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，催乳素受体蛋白的表达量与肛周脓肿患者的临床病理参数的关系采用χ2检验。采用单因素二分类Logistic回归预测分析影响肛周脓肿预后相关的因素，将单因素分析得到的有统计学意义的变量纳入多项Logistic回归进行多因素分析，计算比值比（OR）及其95%可信区间（95% CI），以p＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、 免疫组化结果两组标本PRLR表达比较

免疫组化结果显示，PRLR蛋白在肛周脓肿组（A）低表达（弱阳性）率为68.33%（41/60）及高表达（强阳性）率31.67%（19/60），与单纯痔病对照组（B）PRLR蛋白高表达（强阳性）相比，差异具有统计学意义（χ2=5.701，p＜0.05）。阳性的棕色颗粒主要弥漫性分布在细胞膜中，部分可见于细胞质。图1。

图1 免疫组化检测PRLR结果×100（箭头指示）：1A肛周脓肿患者肛管黏膜标本高表达；1B肛周脓肿患者肛管黏膜标本低表达；1C痔疮患者肛管黏膜标本高表达；1D痔疮患者肛管黏膜标本低表达

二、 Western blot结果两组标本PRLR表达比较

Western Blot结果显示PRLR蛋白在肛周脓肿患者肛管黏膜组织（A）中的表达灰度比值为（0.515±0.067）明显低于对应的单纯痔病对照组（B）灰度比值（0.836±0.035）（t=3.14，P＜0.01）。见图2。

图2 A 两组标本Western blot相对灰度比值 图2B两组患者Western blot检测PRLR蛋白电泳结果

三、 PRLR表达与肛周脓肿患者临床病理特征的关系

PRLR蛋白表达与脓肿患者脓肿范围（χ2=6.406，P=0.011）、脓肿性质（χ2=6.782，P=0.009）相关（均P＜0.05），而与年龄（χ2=0.960，P=0.327）、性别（χ2=0.477，P=0.490）、BMI指数（χ2=2.330，P=0.127）、药物治疗史（χ2=2.080，P=0.179）及脓肿位置（χ2=0.960，P=0.327）等无相关（均P＞0.05）（见表1）。

四、 PRLR表达与肛周脓肿预后的关系

60例肛周脓肿随访期间，无失访病例。全组患者未愈为34例，占56.67%。其中PRLR低表达与高表达，分别为65.85%（27/41）和36.84%（7/19），差异有统计学意义（χ2=4.450，P＜0.05）（见图3）。单因素二分类Logistic回归预测分析结果显示，脓肿范围、脓肿性质、脓肿切口及PRLR低表达量与患者预后相关（均P＜0.05）（见表2）。进一步多项Logistic回归进行多因素分析结果显示，脓肿性质（OR=7.911，95%CI：1.115~20.161，P=0.039）、脓肿切口（OR=3.246，95%CI：0.774~5.742，P=0.042） 及 PRLR 低表 达 量（OR=9.099，95%CI：1.727~14.426，P=0.016）是肛周脓肿患者预后不良的独立危险因素（均P＜0.05）（见表3）。

表1 PRLR表达与肛周脓肿患者临床病理特征的关系

图3 PRLR高表达与低表达总体治愈率的比较

表2 PRLR表达与肛周脓肿预后的单因素关系

表3 PRLR表达与肛周脓肿预后的多因素关系

讨 论

尽管对于肛周脓肿的感染机制及手术方式的研究已经取得了较好的进展，但要阐明其分子机制仍有大量的工作需要完成，而分析肛周脓肿组织与正常组织中的蛋白差异性表达是研究其发病机制的重要途径之一。催乳素受体（PRLR）属于Ⅰ型细胞因子受体超家族成员，由三种不同的短型、中间型和长型结构域蛋白串联而组成的一种模体。其中通过结构域介导蛋白质之间的相互作用，使得配体/受体结合，传递生物信号，调控基因表达，实现复杂的生物功能［7-8］。

据文献报道，在关节炎、自身免疫性炎症、动脉硬化、心肌炎等多种组织中，PRLR在炎性组织中表达具有特异性变化［9-12］。本研究从临床表型入手，60例肛周脓肿肛管黏膜标本通过免疫组化和Western blot两种实验方法分析PRLR的表达情况。免疫组化实验结果显示，阳性棕色颗粒弥漫分布在细胞各处，主要以胞膜为主，也有部分分布在细胞质中，提示PRLR可能起到胞膜上的受体信号传递作用。而肛周脓肿组织PRLR多数成低表达，推测PRLR低表达量可能促进了肛周炎性的发展变化。相关病理亦证实［13］，PRLR受体蛋白低表达于巨噬细胞膜表面，传递第二信号，增强炎症因子的表达。近年来，巨噬细胞在炎症组织中高表达，可预测疾病的预后情况［14］。Feuerstein等［15］人研究发现巨噬细胞高度存在皮肤黏膜感染组织中。因此，本研究尝试对比肛周脓肿患者的临床病理资料，解释PRLR蛋白表达与肛周脓肿的关系。结果显示，PRLR低表达与患者的肛周脓肿范围及脓肿复杂程度相关，进一步提示PRLR蛋白低表达与肛周脓肿形成及进展机制关系密切。Soto等［16］在研究细菌感染机制时，发现PRLR低表达可通过抑制对SHK-1细胞TLR1和TLR5M的免疫刺激，参与感染形成，与本实验结果一致。而同时，Vicent Goff i n等［17］人提出PRLR表达情况可作为疾病预后的独立指标。因此，为了进一步研究PRLR低表达情况与肛周脓肿预后关系，本研究通过建立在随访临床资料与PRLR表达量的数据基础上，进行了单因素及多因素的Logistic回归分析。结果显示，脓肿复杂程度、脓肿单切口及PRLR低表达量是肛周脓肿患者预后的独立危险因素。可进一步分析得出，PRLR低表达量与肛周脓肿患者未俞关系密切。已有研究表明［18］，长期未愈/复发炎症病灶存在刺激局部组织免疫微环境，通过调节PRLR低表达量，减少诱导内源性TNF-α、IL-6和IL-β等细胞因子释放，进而促使炎症恶化。因此，我们推测低表达量PRLR可减少诱导或调节免疫细胞释放炎性因子，进而参与肛周脓肿感染机制的形成及预后不良密切相关。虽然本研究的实验结果也从临床角度分析了上述基础实验的结论，但PRLR低表达受多种调节因素影响，可能需要联合其他指标提高预测复发的敏感性和特异性。

综上所述，人PRLR在肛周脓肿患者组织中表达显著降低，同时低表达的PRLR对判断术后肛周脓肿患者预后具有较好的参考价值。但是因为PRLR调节机制复杂，其是否可以作为临床上可应用的肛瘘复发的预测指标，尚需要进一步的深入研究。

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Association of prolactin receptor experssion in human perianal abscess with postoperative prognosis

Tao Yong, Yang Guangen, Qiu Jianming, Xu Kan, Wang Dong, Wang Hongtao.
Department of Colorectal Surgery, Zhejiang Chinese Medicine University Aff i liated No.3 Hangzhou Hospital, Hangzhou 310009, China

Xu Kan, Email: 15168427344@qq.com

Objective To investigate the association of prolactin receptor (PRLR) expression in human perianal abscess with its prognosis,which may be a new prognosis biomarker of perianal abscess-related.Methods Clinical data and resection samples of 60 patients with perianal abscess identif i ed by pathology undergoing resection in our department from August 2015 to August 2016 were collected as well as 8 patients receiving only hemorroidectomy (control group), matching with perianal abscess group in age, gender and body weight. The PRLR expression in perianal abscess tissues and matched nonabscess tissues collected was detected by immunohistochemical staining and Western blotting. The associations of PRLR level with overall prognosis,clinicopathological features were analyzed, univariate and multivariate logistic regression analysis. Results Immunohistochemical staining showed that the positive brown granules were mainly distributed on the cell membrane,and also in cytoplasm partially. And the low expression of PRLR protein in perianal abscess group was 81.67% (41/60) and high espression wsa 31.67% (19/60), which was significantlyhigher than that of control group (p＜0.05). The relative gray value of Western blotting in perianal abscess tissues were 0.515±0.067, which were significantly lower than those of matched nonabscess tissues(0.836±0.035 andp＜0.05). Patients with low expression of PRLR protein had poor prognosis than those with low expression (68.85% vs. 36.84%,p＜ 0.05). Univariate and Multivariate logistic regression analysis showed that the complexity of abscess (OR=7.911, 95%CI: 1.115~20.161, P=0.039), the number of surgical incision (OR=3.246, 95%CI: 0.774~5.742, P=0.042) and the expression of PRLR protein (OR=9.099,95%CI: 1.727~14.426, P=0.016) were independent risk factors for poor prognosis of patients with perianal abscess (allp＜0.05). Conclusions PRLP expression in perianal abscess patient was low, which may be a valuable in predicting prognosis.

Anal canal; Prognosis; Prolactin receptor; Perianal abscess

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2017.06.009

杭州市科技局重点专科专病项目（No.20160533B27；No.20150733Q28）；浙江省自然科学基金项目（No.LY15H030001；LY15H160001）

310009 杭州，浙江中医药大学附属杭州第三人民医院肛肠科

徐侃，Email：15168427344@qq.com

2017-05-22）

杨明）

陶勇, 杨关根, 裘建明, 等. 人催乳素受体蛋白在肛周脓肿患者中的表达及其与预后的关系 [J/CD]. 中华结直肠疾病电子杂志, 2017, 6(6): 488-493.