清蛋白维生素C片的安全性毒理学评价

杨 晓，王 畋，2，刘 畅，黄 莹，邹国林

(1.武汉跃莱健康产业有限公司研究院，湖北 武汉 430090；2.中国保健协会，北京 100142；3.武汉大学生命科学院，湖北 武汉 430072)

清蛋白维生素C片的安全性毒理学评价

杨 晓1，王 畋1，2，刘 畅1，黄 莹1，邹国林3*

(1.武汉跃莱健康产业有限公司研究院，湖北 武汉 430090；2.中国保健协会，北京 100142；3.武汉大学生命科学院，湖北 武汉 430072)

根据我国卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)，通过小鼠急性毒理学试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、鼠伤寒沙门菌/哺乳动物微粒体酶试验(Ames试验)、大鼠30 d喂养试验对清蛋白维生素C片的安全性毒理学进行评价。结果表明，清蛋白维生素C片的小鼠无毒，急性经口最大耐受剂量大于20 g·(kg BW)-1；清蛋白维生素C片的小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验和Ames试验的结果均为阴性；1.5 g·kg-1、3.0 g·kg-1、6.0 g·kg-1剂量组大鼠喂养30 d的生长状况良好，摄食量和体重不断增加，各个脏器绝对重量和血液值都处于正常水平，无任何异常情况。可以判定清蛋白维生素C片具有较好的食用安全性。

清蛋白维生素C片；安全性；毒理学；评价

清蛋白多肽作为一种功能性大分子蛋白质，对调节人的免疫系统、提高血清蛋白含量、改善身体循环、增强体质、预防疾病都有着较好的作用[1-2]，是人体不可或缺的营养物质[3]。研究表明，清蛋白多肽对肠道菌群具有调节作用，对短肠综合征有促进康复作用，对消化系统具有明显的改善作用，同时还具有促进铁的吸收的功能。在食品中添加清蛋白多肽类物质，对肝肾疾病、消化系统疾病以及老年人体质差等具有良好的营养支持和辅助治疗作用。

维生素C(L-抗坏血酸)是一类在水果蔬菜中广泛存在的维生素，是人体必需的微量营养元素之一，也是人体需要量最大的一种维生素[4]。维生素C对恶性贫血、坏血病、动脉粥样硬化、衰老、癌症等具有预防和治疗作用[5-8]，同时也参与合成胶原蛋白、促进类固醇的代谢、维持骨骼和牙齿的正常功能、维持细胞膜的完整性，还具有增强机体免疫力的能力[9]。目前，许多疾病的发生均与机体的免疫功能低下有关，补充适量的维生素C可以纠正和提高机体的免疫反应[10]。维生素C主要通过调节各种免疫细胞的生长和分化影响细胞因子、趋化因子和活性氧的水平，提高白细胞的吞噬能力，提高人体对疾病的抵抗力和对寒冷的耐受力，在机体免疫反应中发挥着重要的作用[11-12]。

清蛋白多肽是一种生物活性较强的蛋白质，广泛应用于食品、医药等行业，文献报道清蛋白多肽有较强的生物活性，例如：具有较强的抗氧化活性[13]，并能显著提高亚急性衰老小鼠的抗氧化能力[14]，改善小鼠学习记忆功能[15]，对钙有明显的吸收作用，能增加骨中钙的含量[16]，增强免疫力[17]。

以清蛋白多肽粉和维生素C为主要原料制成的清蛋白维生素C片，具有生物利用率高、稳定性好、卫生等优点，同时还具有抗氧化、预防和抵抗疾病、维持机体正常运行的功能；并通过了国家食品药品监督管理局检测机构的检测。作者通过小鼠急性毒理学试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、鼠伤寒沙门菌/哺乳动物微粒体酶试验(Ames试验)、大鼠30 d喂养试验等5项食品安全性毒理学试验研究清蛋白维生素C片的安全性，以期为清蛋白维生素C片开发成为保健食品提供理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

清蛋白维生素C片，自制，主要成分为清蛋白多肽粉、维生素C、微晶纤维素、包衣粉等。清蛋白多肽粉，武汉天天好生物制品有限公司；维生素C，石药集团维生药业(石家庄)有限公司；微晶纤维素，浙江巨星生物材料有限公司；包衣粉，上海新菲尔生物制药工程技术有限公司。

磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、甲醇、氯化钠、二甲亚砜、氯化镁、氯化钾、硫酸钠、环磷酰胺、Giemsa染液、伊红染色液、牛肉膏、胰蛋白胨、琼脂粉、营养肉汤培养基、磷酸氢钠铵、柠檬酸、硫酸镁、葡萄糖、结晶紫溶液、四环素、氨苄青霉素，国药集团化学试剂有限公司；D-生物素、L-组氨酸、辅酶Ⅱ，上海春晓生物技术有限公司；小牛血清，北京博尔西科技有限公司。

ACS-3A 90401582型电子秤，上海信衡电子有限公司；BP310S-91006909型天平、JH56101 2026型电子天平、CP124S 138006200型电子天平、Sartorius CP124S 13806202型电子天平、Bp3100s 91006823型电子天平，德国赛多利斯有限公司；eclipse 80i50686型Nikon显微镜，北京中仪光科科技发展有限公司；GNP-9270型隔水式恒温培养箱，上海顿克仪器科技有限公司；AU68054854型全自动生化仪，美国贝克曼库尔特有限公司；XT-2000i 66541型血液分析仪，希森美康医用电子(上海)有限公司；Mikro22 1105型台式离心机，杭州普瑞特仪器有限公司；HM340E 15782型切片机，上海名元实业有限公司；HMP110 15784型脱水机，东莞启隆研磨机械有限公司；AP280 15787型包埋机，孝感亚光医用电子技术有限公司；HMS70 15788型染色机，上海倍曼生物科技有限公司。

1.2 试验动物与菌株

SPF级昆明种小鼠(生产许可证号：SCXK(沪)2013-0006，试验动物使用许可证号：SYXK(沪)2013-0008)，上海斯莱克实验动物有限责任公司；SPF级SD大鼠(生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016，试验动物使用许可证号：SYXK(沪)2013-0008)，上海西普尔-必凯实验动物有限公司；动物饲料(登记证号：苏饲审(2009)05032)，饲养温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，苏州双狮实验动物饲料科技服务有限公司。

菌株TA97、TA98、TA100、TA102由美国分子毒理学有限公司提供，产品质量保证书批号分别为：4584D、4599D、4600D、4604D，经生物学特性鉴定符合试验要求。将保存好的菌株取出，制作主平板，选择分离度好的单菌落悬浮于15 mL营养肉汤培养基中，于37 ℃、120 r·min-1振荡暗培养12 h。

1.3 方法

参照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)毒理学检验方法[18]分别进行如下试验：小鼠急性毒理学试验(最大耐受剂量(MTD)试验方法)、小鼠骨髓细胞微核试验(Giemsa染色法)、小鼠精子畸形试验、Ames试验(平板掺入法)、大鼠30 d喂养试验。

1.4 数据分析

采用SPSS16.0软件进行方差分析。

2 结果与讨论

2.1 小鼠急性毒理学试验

将雌雄小鼠各10只按20 g·kg-1剂量喂食清蛋白维生素C片，进行急性经口毒性试验，结果见表1。

表1 小鼠急性毒性试验结果

试验期间雌雄小鼠活动正常，毛色光泽度好，体重逐渐增加，未见任何症状和死亡。本试验的使用剂量是20 g·kg-1，因此雌雄小鼠的最大耐受剂量均大于20 g·(kg BW)-1，按照急性毒性试验的分级，清蛋白维生素C片对小鼠是无毒的。

试验结束后将小鼠处死，解剖后肉眼观察到小鼠各个脏器并无任何异常。

2.2 小鼠骨髓细胞微核试验

将雌雄小鼠各25只，均分成5组：阴性对照组(蒸馏水20 mL·kg-1，下同)、阳性对照组(环磷酰胺40 mg·kg-1，下同)、2.5 g·kg-1剂量组、5.0 g·kg-1剂量组、10.0 g·kg-1剂量组，进行小鼠骨髓细胞微核试验，受检细胞数均为5 000，结果见表2。

由表2 可知，与阴性对照组相比，阳性对照组微核率具有显著性差异(P<0.01)，而清蛋白维生素C片各剂量组的PCE/NCE值与微核率均无显著性差异，无统计学意义(P>0.05)。表明，清蛋白维生素C片的小鼠骨髓细胞微核试验结果为阴性，清蛋白维生素C片对小鼠骨髓细胞无抑制作用。

表2 小鼠骨髓细胞微核试验结果

注：PCE/NCE为嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值；**表示与阴性对照组相比(经卡方检验)，P<0.01。

2.3 小鼠精子畸形试验(表3)

表3 小鼠精子畸形试验结果

注：**表示与阴性对照组相比(经卡方检验)，P<0.01。

由表3可知，与阴性对照组相比，阳性对照组精子的畸形率具有显著性差异(P<0.01)；而清蛋白维生素C片3个剂量组的精子畸形率无显著性差异(P>0.05)。表明，清蛋白维生素C片的小鼠精子畸形试验结果为阴性。

2.4 Ames试验(表4)

由表4可知，在2次试验中无论是否加入S9活化系统，清蛋白维生素C片8～5 000 μg·mL-1剂量组的回复菌落数小于溶剂对照组的2倍，呈阴性反应，并且未见计量-反应关系；而各个阳性对照组的回复菌落数均为空白对照组的2倍以上，呈明显的阳性反应，有强烈的诱变作用。因此，清蛋白维生素C片的Ames试验结果为阴性。

2.5 大鼠30 d喂养试验

2.5.1 对大鼠每周体重、摄食量、增重、食物利用率的影响(表5)

试验期间，大鼠的生长状况良好，无任何异常情况。由表5可知，雄性大鼠和雌性大鼠的体重和摄食量不断增加，且雄性大鼠的体重和摄食量的增加幅度明显大于雌性大鼠；雄性大鼠对食物的利用率大于雌性大鼠；在不同时间点时，各个剂量组大鼠的体重和摄食量与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。表明，清蛋白维生素C片对大鼠的体重和摄食量无影响。

表4 Ames试验结果

注：空白对照组(蒸馏水0.1 mL)，溶剂对照组(二甲基亚砜0.1 mL)，ICR、对硝基喹啉、甲基甲烷磺酸酯、2-氨基芴、1,8-二羟基蒽醌为阳性对照。括号内数值为剂量。

2.5.2 对大鼠脏器绝对重量及脏/体比的影响(表6)

由表6可知，不管是雄性大鼠还是雌性大鼠，与对照组相比，低、中、高剂量组的清蛋白维生素C片对其肝脏、肾脏、脾脏以及睾丸(卵巢)的绝对重量基本没有影响，脏/体比基本一致，无统计学意义(P>0.05)。表明，清蛋白维生素C片对大鼠脏器没有影响。

2.5.3 对大鼠血常规的影响(表7)

由表7可知，雄性大鼠和雌性大鼠各个剂量组的白细胞和红细胞个数与对照组基本没有差异，不具有统计学意义；每升血液中血红蛋白的含量与对照组相比，无统计学意义；在检测白细胞时，其中淋巴细胞、单核细胞、中性细胞、嗜酸细胞以及嗜碱细胞所占的百分比与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。表明，清蛋白维生素C片对大鼠的血液没有影响。

表5 大鼠体重、摄食量、增重、食物利用率

注：括号外为雄性大鼠数据，括号内为雌性大鼠数据。

表6 大鼠脏器绝对重量及脏/体比

表7 大鼠的血常规测定结果

2.5.4 对大鼠血液生化值的影响(表8)

表8 大鼠血液生化指标检测结果

由表8可知，大鼠各个剂量组的谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐、葡萄糖、甘油三酯、胆固醇的含量与对照组相比基本一致，无统计学意义(P>0.05)。表明，清蛋白维生素C片对大鼠各项生化指标无影响。

2.5.5 组织病理学检测

通过显微镜观察6.0 g·kg-1剂量组和对照组大鼠喂养30 d后的组织病理学变化，发现：(1)肝脏被膜未发生改变，肝小叶无坏死、出血、空泡变、颗粒变性、肝细胞索断裂、肝细胞肿胀、炎症细胞浸润、嗜酸变发生，汇管区无坏死、出血、胆管增生、炎症细胞浸润及其它现象发生。(2)肾脏被膜未发生改变；皮质部肾小管上皮细胞无坏死、肿胀、空泡变、管型、炎症细胞浸润发生，皮质部肾小球未发生变性，皮质部间质内未发生病变，皮质部未发生脓肿；髓质部曲管上皮细胞无坏死、肿胀、空泡变、管型、炎症细胞浸润发生，髓质部无一例间质炎症细胞浸润、无一例扩张；肾孟部乳头无一例改变，移形上皮细胞也无一例改变。(3)对照组雌性大鼠有1例脾脏红髓轻度扩张，雄性大鼠组织未见明显病理学改变；6.0 g·kg-1剂量组雌性大鼠有2例脾脏红髓轻度扩张，雄性大鼠有1例红髓轻度扩张；无一例白髓萎缩、造血细胞增生、炎细胞浸润、色素沉着等其它病变发生。(4)胃肠无一例黏膜出血、水肿、炎细胞浸润、坏死、萎缩、增生等病变发生。(5)雄性大鼠睾丸无一例生精上皮细胞减少、生精上皮细胞变性、生精上皮细胞坏死、多核巨细胞、间质出血、间质水肿等病变发生。(6)雌性大鼠卵巢无一例萎缩、变性、出血、水肿、囊肿、淤血等病变发生。综上，各试验大鼠大体检查均无异常，肝、肾、脾、肠胃、性器官等主要脏器的组织学检查未发现与受试样品有关的病理改变。

在本试验条件下，以1.5 g·kg-1、3.0 g·kg-1、6.0 g·kg-1剂量的清蛋白维生素C片对大鼠进行30 d 喂养试验。结果发现：大鼠的生长状况良好，摄食量和体重不断增加，各个脏器绝对重量和血液值都处于正常水平，无任何异常情况。表明，清蛋白维生素C片具有较好的食用安全性。

3 结论

通过小鼠急性毒理学试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、Ames试验和大鼠30 d喂养试验对清蛋白维生素C片作为功能性食品食用的安全性毒理学进行了研究。结果表明，清蛋白维生素C片对小鼠急性经口最大耐受剂量大于20 g·(kg BW)-1，属于无毒的；清蛋白维生素C片的小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验和Ames试验的结果均为阴性；大鼠30 d喂养试验结果表明，1.5 g·kg-1、3.0 g·kg-1、6.0 g·kg-1剂量组大鼠的生长状况良好，摄食量和体重不断增加，各个脏器绝对重量和血液值都处于正常水平，无任何异常情况。表明，在本实验条件下清蛋白维生素C片具有较好的食用安全性。

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SafetyandToxicologyAssessmentofAlbuminVitaminCTablets

YANG Xiao1,WANG Tian1,2,LIU Chang1,HUANG Ying1,ZOU Guo-lin3*

(1.ResearchInstituteofWuhanTwinklifeHealthIndustryCo.,Ltd.,Wuhan430090,China; 2.ChinaHealthCareAssociation,Beijing100142,China; 3.CollegeofLifeScience,WuhanUniversity,Wuhan430072,China)

According to theTechnicalStandardsforTestingandAssessmentofHealthFood(2003) by Healthy Ministry,we evaluated the safety and toxicology of Albumin Vitamin C Tablets by mice acute toxicity test,mice bone marrow cell micronucleus test,mice sperm abnormality test,Salmonellatyphimurium/mammals microsomal enzyme test(Ames test),and 30 days feeding test in rats.The results indicated that the mice maximum tolerated dose of Albumin Vitamin C Tablets was more than 20 g·(kg BW)-1,so the sample fell into the scale of non-toxicity.The results of mice bone marrow cell micronucleus test,mice sperm abnormality test,and Ames test were all negative.The results of 30 days feeding test showed that the rats of each dose group(1.5 g·kg-1，3.0 g·kg-1，6.0 g·kg-1) were well alive,food intake and weight gain continued to increase,and all organs absolute weights and blood values were at a normal level,without any abnormalities by detection.Therefore,we can determine the Albumin Vitamin C Tablets have good food safety.

Albumin Vitamin C Tablets;safety;toxicology;assessment

2017-08-01

杨晓(1986-)，女，湖北武汉人，硕士研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail：meredith.yang@twinklife.com；通讯作者：邹国林，教授，E-mail：zouguolin@whu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.12.015

杨晓，王畋，刘畅，等.清蛋白维生素C片的安全性毒理学评价[J].化学与生物工程，2017，34(12)：63-69.

TQ466.3 R285

A

1672-5425(2017)12-0063-07

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