纳米孔DNA测序专利技术综述

马妍妍

（国家知识产权局专利局专利审查协作四川中心，四川 成都 610000）

纳米孔DNA测序专利技术综述

马妍妍

（国家知识产权局专利局专利审查协作四川中心，四川 成都 610000）

基于CNABS和DWPI数据库，通过检索、统计和分析国内外有关纳米孔DNA测序的专利申请，对该领域申请量趋势进行统计，梳理了纳米孔DNA测序领域的技术发展历程，同时，对纳米孔DNA测序领域的核心专利和重要申请人进行分析，以期为国内相关企业的发展提供参考。

纳米孔；测序；核心专利；技术发展

引言

基因测序技术是对DNA进行分析、检测的技术，在产前筛查和诊断，以及多种疾病的诊断、预测、预防干预等方面具有重要意义。从测序技术的发展演变来看，基因测序技术主要经历了4代：基于1975年Sanger和Coulson发明的脱氧终止法的测序原理的第一代基因测序技术，到以新型的固态纳米孔单分子测序为特点的第四代基因测序，目前,第四代基因测序技术正处在研究热潮。纳米孔DNA测序技术借助电泳驱动单个分子逐个穿过纳米孔来进行测序。与传统的基因测序技术相比，纳米孔DNA测序技术具有低成本、高读长、小型化、易集成等优势，近年来发展非常迅速。为了解掌握纳米孔DNA测序技术的发展及产业现状，从全球纳米孔DNA测序技术的专利入手，研究分析纳米孔DNA测序技术的专利申请趋势、重要申请人、专利技术发展历程等相关信息，以期为国内相关企业提供参考。

1 纳米孔DNA测序技术分支

基于CNABS、DWPI数据库，通过分类号和关键词检索，人工去噪得到供分析的纳米孔DNA测序技术专利数据样本536篇文献。通过浏览专利和相关非专利文献，对纳米孔DNA测序所涉及的技术分支进行分解（详见表1）。

2 全球申请量趋势分析

对检索到的纳米孔DNA测序专利申请按申请年份分别统计申请量。

数据显示（见图1），1996年，哈佛大学的Daniel Bran⁃ton、加州大学的David Deamer及其同事，在PNAS杂志上首次发表文章指出，可以用膜通道检测多核苷酸序列，让DNA碱基一个个穿过纳米孔，同时快速鉴定每个碱基。1998年加州大学和哈佛大学作为申请人，首次申请了纳米孔DNA测序相关专利。然而，为致力于解决遇到的大量生产同样尺寸的纳米孔、DNA链穿过纳米孔时的速度等问题，纳米孔测序技术在1998年-2001年间进入了萌芽期。

2001年，哈佛大学的Daniel Branton和Golovchenko等首次报道了使用固态纳米孔来检测DNA，在SiN薄膜中使用具有反馈控制的离子束雕刻工具制备确定尺寸的纳米孔。从2002年开始，国内外各公司、研究机构开始对纳米孔测序技术产生关注，相关专利申请进入了发展期，2007年-2014年间，纳米孔测序技术的专利申请迅猛增长。

2014年之后的专利申请量急剧下降，其原因可能有两个，其一是由于基因测序相关企业入行门槛低、市场比较混乱，存在巨大风险，2014年国家食药监管总局、国家卫计委联合发出通知叫停了产前基因检测在内的基因测序，可能对申请量造成了一定的影响。其二是由于部分专利申请还未公开。

图1 全球申请量趋势

3 全球重要申请人分析

对各申请人的申请量进行分析，将不同公司名称（中英文）进行人工整合后，以申请量为准对申请人进行排名，结果显示如图2。

全球纳米孔DNA测序技术专利申请量排名前20的重要申请人中，国际商业机器公司（IBM）作为电子计算机行业的领头羊申请量位居第一，2007年开始涉足纳米孔DNA测序领域。而作为纳米孔DNA测序技术的始创者，哈佛大学和加利福尼亚大学申请量位居第二和第五名。此外，前20名申请人中，深圳华大基因科技有限公司是国内领先的基因测序企业，自1990年“人类基因组计划”启动至2003年，华大基因参与并完成了1%的人类基因组计划，之后的10多年间，华大基因在利用基因检测进行产前检测方面投入了很大的精力，其在纳米孔DNA测序方面的专利申请也持续增长，在全球申请量排名第九。伊鲁米那（Illumina）公司作为测序领域的巨头，在基因测序产业链上利润最大的上游设备端和耗材领域占有最重的市场份额，许多国内基因测序企业从Illumina公司购买基因测序设备。牛津纳米孔为英国的一家基因测序公司，早在2012年，牛津纳米孔公司就发布了一款U盘大小的DNA测序器，将其命名为MinION，它可以直接通过USB连接到笔记本上，使用的技术便是纳米孔DNA测序技术，一个MinION有500个纳米孔，可并行测序，每个孔每秒30bp，该测序器在2016年8月被NASA宇航员带上了太空，开启了太空基因组测序的新篇章。

在申请量排名前20的申请人中，国外申请人占13个，超过半数，国内申请人相对较少，这反映了与国外纳米孔DNA测序技术相比，国内还存在一定的差距。而排名前20的国内申请人中，申请量位居第一的为上海交通大学，其专利申请主要涉及通过电磁或光学镊手段捕获DNA一端的磁珠来减慢DNA穿过纳米孔的速度、借助外切酶进行测序以及制备固态纳米孔方面的研究。东南大学、浙江大学、北京大学、清华大学在纳米孔DNA测序领域研究也位居国内申请人排名前七，近年来，北京大学与哈佛大学在DNA在固态纳米孔中的减速方法方面有多项合作，这种国内外高校的合作模式也推进了我国纳米孔DNA测序技术的发展。

表1 纳米孔DNA测序技术分支

图2 全球申请人申请量排名

4 重要申请人专利技术发展及核心专利

哈佛大学和加利福尼亚大学（即加州大学）是最早提出纳米孔DNA测序这一技术的申请者，为纳米孔DNA测序领域的始创者，且二者申请量分别位居第二和第五，他们的后续研究也是围绕纳米孔测序在开展，其研究技术发展历程在一定程度上反映了纳米孔DNA测序领域的发展方向。

4.1 测序的检测方式

测序的检测手段经历了从检测离子流阻断、到通过光学读取、通过横向电子隧穿、再到通过电容检测的发展。由哈佛大学和加利福尼亚大学合作最早提交的专利（US6746594B2，1998年）是根据离子流阻断原理进行DNA的纳米孔直接测序。随后的一系列专利都是关于离子流检测的纳米孔直接测序的研究。2003年加利福尼亚大学申请的专利（US7444053B2）和2004年哈佛大学申请的专利（CN101103357B）中，均使用光学手段读取的检测方式对DNA进行纳米孔测序，通过读取荧光信号推测DNA的序列。横向电子隧穿的检测方式在哈佛大学于2005年相继提交的专利（CN102183630A和CN101203740A）中被使用，这两篇专利文献中均使用碳纳米管在纳米孔处产生横向偏电压，使得DNA在穿过纳米孔时速度减慢。在之后的研究中，加利福尼亚大学2013年申请了专利（US2015337367A1），其中，将纳米孔测序仪在半导体基板上制作，使得微缩的多纳米孔检测设备成为可能，另外测序仪中还集成设置了复合膜片钳电容放大器-差分放大器网络，提高了检测信噪比，通过电容检测的方式进行DNA测序。

4.2 测序所使用的纳米孔的发展

主要经历了从生物蛋白质纳米孔到固态纳米孔的转变。对于生物蛋白质纳米孔而言，以α-溶血素（英文简称α-HL）为例，α-HL蛋白是金黄色葡萄球菌分泌的分子量为232.4kDa的蛋白质，以七聚体方式插入脂质双分子层中形成跨膜通道蛋白[4]，由2个主要部分组成：约2.5nm内径的帽子和约1.5nm内径的通道，后者穿过细胞膜，帽子宽约10nm，整个α-HL纳米孔从帽子到通道长约10nm，当KCl浓度为1mol/L时，α-HL纳米孔通道大约可容纳11个K+和11个Cl-[5]。哈佛大学和加利福尼亚大学早期的研究多集中在使用生物蛋白质纳米孔来检测核酸。而最早使用的α-HL纳米孔的通道有约5nm长，可同时容纳约7个核苷酸，这就造成检测的干扰，这种纳米孔不能分辨通道中的7个核苷酸，其空间和时间分辨率较低。在这之后哈佛大学和加利福尼亚大学的申请也多集中于生物蛋白质纳米孔的测序技术，并相继提交了使用MspA孔蛋白（WO2016053891A1）、噬菌体Phi29连接器（CN103392008A）等生物纳米孔进行测序的专利。

生物纳米孔在测序方面进展较早，但由于其自身在稳定性、持久性等方面存在不足，难以满足持续的大规模测序工作的需求。随着微加工技术的不断进步，固态纳米孔技术应运而生。固态纳米孔测序原理与生物纳米孔一样，其是人造纳米孔，但与生物纳米孔相比，具有更优良的性质：一是尺寸可控；二是更好的机械强度、稳定性；三是可重复使用，成本降低；四是可适应复杂的检测环境；五是易于与其他微型探测器和探针或分析电路集成具备单分子检测能力的灵敏生物传感器，其克服了生物纳米孔的一系列缺点。1999年加利福尼亚大学提交的专利（US6617113B2）中在云母层上利用HF酸进行湿法腐蚀得到固态纳米孔，且使用这种固态纳米孔区分单链、双链核酸分子。2001年，Li等发表了关于聚焦离子束制备直径为1.8nm纳米孔的研究，之后，哈佛大学在2003年提交的专利（WO2005061373A1）中使用离子束刻蚀的方法制备纳米孔用于纳米孔DNA测序。2005年之后哈佛大学的纳米孔DNA测序技术的专利申请多集中在使用固态纳米孔进行测序，2013年哈佛大学提交的专利申请（CN105408241A）中使用电子束刻蚀制备的固态纳米孔进行DNA测序研究。

4.3 纳米孔DNA测序的技术难点

主要集中：在一是如何提高单碱基检测灵敏度；二是如何减慢DNA穿孔速率这两大方面。这两方面又相辅相成，减慢DNA穿孔的速率则在检测时间上有了保障，进而便可提高单碱基的检测灵敏度。哈佛大学2004年提交的专利申请（CN101103357B）借助杂交探针与靶核酸之间的相互作用来减缓纳米孔穿线速度，其于2005年提交的两项专利（CN102183630A和CN101203740A）均使用碳纳米管与DNA分子的耦合作用减慢DNA穿过纳米孔的速度。而后哈佛大学还围绕增加检测灵敏度进行了研究，分别在2008年和2009年提交了两项专利（WO2009/035647Al和CN102630304A），使用石墨烯纳米孔进行检测，由于石墨烯膜很薄，其厚度小于DNA两个碱基之间的间距，因此可提高单碱基检测的灵敏度。此外，加利福尼亚大学于2011年申请的专利（CN104774757A）中使用两个纳米孔，并在两个纳米孔上施加不同的电压，产生相反方向的作用力来减慢DNA穿过纳米孔的速率，以期提高检测准确率。2012年申请的专利（CN102590314B和CN102621214B）中，哈佛大学又提出了新的手段，这两篇专利文献是与北京大学合作完成的，其中通过引入压强外场作为电场的反向外场来减慢DNA穿孔的速率。

5 结语

基因测序领域自基于Sanger的脱氧终止法的第一代基因测序至今已经历了将近40年的发展历程。而从专利发展的演进来看，纳米孔DNA测序技术始于1998哈佛大学和加利福尼亚大学共同提出的生物纳米孔的离子流阻断检测，至今也经历了10余年的发展。纵观纳米孔DNA测序技术的发展历程，该技术领域主要围绕纳米孔的制备方法、纳米孔尺寸的缩小、减缓DNA穿孔速度、提高检测灵敏度这4方面进行研究。通过技术综述的梳理，便于了解上述4方面的重点专利技术，该领域的重点申请人，对国内企业有一定的参考意义。

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Review of Patents in Nanopore DNA Sequencing

Ma Yanyan
（Patent Examination Cooperation Sichuan Center of the Patent Office,SIPO,Chengdu Sichuan 610000）

Based on the databases of CNABS and DWPI,the domestic and foreign patents of nanopore DNA se⁃quencing are analyzed by examination and statistics method,including the growth trend of application amount and the technique progress in the field of nanopore DNA sequencing.Furthermore,the core patents and important ap⁃plicants of nanopore DNA sequencing are analyzed.This paper aims to provide references for the development of re⁃lated domestic enterprises.

nanopore;sequencing;core patents;technique progress

Q812

A

1003-5168(2017)11-0051-04

2017-9-20

马妍妍（1988-），女，硕士，实习研究员，研究方向：发明专利实质审查工作。