抗CD137L单抗对再生障碍性贫血T细胞亚群及细胞因子诱生水平的影响及意义

王志敏，潘学霞，李尊昌，王雨存，王立盼

（1. 滨州市人民医院血液内科；2. 儿科；3. 风湿免疫科，山东 滨州 256600）

检验论著

抗CD137L单抗对再生障碍性贫血T细胞亚群及细胞因子诱生水平的影响及意义

王志敏1，潘学霞2，李尊昌1，王雨存3，王立盼1

（1. 滨州市人民医院血液内科；2. 儿科；3. 风湿免疫科，山东 滨州 256600）

目的探讨抗CD137L单克隆抗体阻断CD137/CD137L信号通路对再生障碍性贫血（aplastic anemia, AA）T淋巴细胞亚群及单个核细胞体外诱生细胞因子水平的影响，及其在AA免疫治疗中的作用和意义。方法采用流式细胞术及ELISA方法，分析AA患者经抗CD137L单抗刺激前后骨髓T淋巴细胞亚群及单个核细胞诱生细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10的变化。结果AA患者经抗CD137L单抗诱导后骨髓CD3+、CD4+、CD8+、CD25+ T细胞比值显著降低（P＜0.05），而对照组T细胞亚群几无影响。抗CD137L使再障患者骨髓单个核细胞IL-2、IFN-γ水平降低，但较正常对照组升高（P＜0.05），使IL-10水平升高，但较正常对照组仍显著降低（P＜0.05）。结论抗CD137L单抗可使AA患者T细胞亚群恢复或接近正常，使免疫状态得到改善，亦可使体外骨髓单个核细胞（BMMNC）中IL-2、IFN-γ水平下降，IL-10水平提高，具有重要意义。

再生障碍性贫血；T淋巴细胞；抗CD137LmAb；细胞因子

再生障碍性贫血（aplastic anemia, AA）是一种骨髓造血功能衰竭性疾病，其发病机制复杂，目前的观点认为，细胞免疫异常介导的造血组织免疫损伤在AA的发病机制中起着重要作用。研究[1,2]已发现，在AA患者中T淋巴细胞活化异常，细胞因子分泌异常。T细胞的活化过程需要抗原信号和共刺激信号分子的双重作用，如果共刺激信号被阻断，则可诱导抗原特异性T细胞免疫。CD137/CD137L是除CD28/B7以外的另一对关键的共刺激信号因子，在T细胞的活化、增殖方面发挥重要作用[3]。抗CD137L单克隆抗体与活化T细胞表面的CD137L分子结合，阻断CD137与CD137L的结合，从而阻断CD137-CD137L信号通路，导致T细胞无反应性并抑制免疫应答[4]。然而，目前国内关于体外阻断CD137-CD137L通路是否能影响T细胞亚群和细胞因子分泌的报道很少，我们通过流式细胞术及ELISA方法，测定AA患者经抗CD137L单抗作用前后T细胞亚群和骨髓单个核细胞在体外诱导的细胞因子变化可初步判断阻断共刺激信号对AA的纠正作用及对细胞免疫的可能作用。

1 对象和方法

1.1 对象 32例AA患者均为2011年4月-2014年11月我院血液科门诊及初诊住院患者，其中非重型AA（NSAA）22例，重型AA（SAA）10例，男性18例，女性14例，年龄12岁-49岁，中位年龄32岁，经血常规、骨髓细胞学、骨髓活检等检查，诊断符合《血液病诊断和疗效标准》。正常对照组16例，取自同期住院的非造血系统疾病患者，其中男性9例，女性7例，年龄14岁-52岁，中位年龄34岁。

1.2 主要仪器和试剂 流式细胞仪（美国becton-Dickinson公司）；37oC CO2培养箱：gbb-16型，上海heraeus公司；低速自动平衡离心机：ldz 5-2型，北京医用离心机厂；台式高速离心机：tgl-16g型，上海医疗分析仪器厂；淋巴细胞分层液（中国医学科学院生物工程研究所）；抗CD137L单克隆抗体（深圳市景美有限公司）、CD3、CD4、CD8 flow单克隆抗体和丝裂霉素、植物血凝素（PHA）（Sigma）。IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ引物（上海生物工程有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集 无菌条件下抽取AA患者骨髓8 mL-10 mL，抽取正常对照骨髓5 mL，肝素抗凝。

1.3.2 分离骨髓单个核细胞（BMMNCs） 密度-梯度法。

1.3.3 骨髓单个核细胞培养 把再障患者BMMNCs分为抗CD137L组、对照组在体外培养5 d后加入PHA（20 μg/mL），然后培养2 d。正常对照组骨髓单个核细胞体外培养5 d，加入PHA（20 μg/mL）2 d。收集培养的骨髓单个核细胞。离心取上清液，过滤，分装，于-20oC冷冻。

1.3.4 ELISA方法检测再障两组及正常组细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10诱生水平。

1.3.5 免疫荧光标记及流式细胞术分析 将BMMNC浓度约1×106个/mL，加入20 μL相应荧光标记单克隆抗体，混匀，室温避光孵育30 min，然后离心去上清，悬浮细胞，4oC固定30 min，上机检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS 10.0软件进行数据分析处理。计数资料采用率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料采用均数±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗CD137L单抗对再障患者骨髓T淋巴细胞亚群分布的影响 再障患者BMMNCS加入抗CD137L单抗后，CD3+、CD4+、CD8+、CD25+细胞的比值较对照组显著减低，差异有统计学意义（P＜0.05)，见表1。

2.2 抗CD137LmAb对骨髓MNC诱生细胞因子水平的影响 加入抗CD137LmAb组较未加组SAA、AA患者骨髓MNC诱生IL-2、IFN-γ水平显著降低（P＜0.05），但显著高于正常对照组（P＜0.05）。加入抗CD137LmAb组较未加组SAA、AA患者骨髓MNC诱生IL-10水平显著增高（P＜0.05），但显著低于正常对照组（P＜0.05）。数据见表2。

表1 抗CD137L单抗对再障患者骨髓T淋巴细胞表型的影响（Mean±SD, %）

表2 抗CD137L单抗对再障患者骨髓MNC诱生细胞因子水平的影响（Mean±SD, ng/mL）

3 讨论

AA的发病机制较复杂，目前观点认为，造血干细胞、造血微环境异常、细胞免疫功能紊乱在AA的发病机制中起着重要作用。其中细胞免疫异常是再障患者免疫发病机制的主要方面。近年来，对AA细胞免疫异常的研究发现，包括T细胞亚群及相关细胞因子水平，提示T细胞异常活化及造血负调控因子的优势在AA发病机制中起重要作用。

CD4+ T细胞按其所产生细胞因子谱可分为Th1、Th2细胞，T细胞亚群的变化主要是TH1/TH2的异常，以及由此引起的细胞因子分泌异常。TH1细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子，TH2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等细胞因子。IL-2可促进T细胞增殖，增强T细胞、NK细胞的活性，除促进IFN-γ的产生外，陈可冀等[5]研究证实，IL-2异常升高与AA患者细胞免疫功能紊乱有关。IFN-γ是T细胞分泌的一种负性造血调节因子，有研究[6]表明微量内源性IFN-γ具有较强抑制作用。IL-10，又称细胞因子产生抑制剂，具有明显的免疫抑制和免疫调节作用，与AA患者细胞免疫紊乱的发生和发展密切相关。T细胞的完全活化需要两个信号：抗原识别信号和共刺激信号，共刺激信号缺乏会导致T细胞无能或免疫耐受[7,8]。AA其实质是以骨髓造血组织为靶器官，细胞免疫异常介导的免疫性疾病，其共刺激信号系统的改变也逐渐受到关注。

1989年Kwon等从活化的鼠T细胞中分离出一种新的膜表面抗原，命名为4-1BB（CD137）[9]，此后的许多研究发现4-1BB属于肿瘤坏死因子受体超家族，其配体属于肿瘤坏死因子超家族，二者是除CD28/B7外的另一对重要的协同刺激信号，在T淋巴细胞的活化过程中起着重要作用。CD137主要通过协同CD3和CD28发挥共刺激作用。Pulle及Myers等研究认为CD137共刺激途径主要促进CD8+ T细胞的增殖与分化，Myers等研究发现，CD137信号通路具有极化效应，表现为I类细胞因子如IFN-γ的分泌增加，II类细胞因子如IL-10的分泌减少。

本研究证实，加入抗CD137L单抗后AA患者骨髓中CD3+、CD4+、CD8+、CD25+细胞比值较对照组明显降低，表明抗CD137L单抗可使再障患者骨髓T淋巴细胞的增殖及活化受到抑制。用ELISA法测定经抗CD137L单抗阻断后骨髓MNC诱生细胞因子的水平，结果表明阻断后IL-2、IFN-γ水平显著下降，且SAA较NSAA中IL-2、IFN-γ有显著增高，这与国内外诸多研究结果相一致，IL-10诱生水平较正常对照显著降低（P＜0.05），SAA患者与NSAA患者之间无统计学差异，说明AA患者存在明显的细胞免疫及细胞因子网络的异常，这可能由于阻断后T细胞的异常活化被抑制，原有的Th1/Th2平衡向Th1偏移现象被部分纠正，因此Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ水平降低，Th2型细胞因子IL-10水平增高。

目前，免疫抑制是临床上治疗再障的主要方法，但此种治疗手段并未使再障的治疗有效率有显著提高，所以探讨其他的治疗方法显得十分必要。研究已表明AA有共刺激信号系统的异常，所以探索共刺激信号途径的变化和干预有可能为AA的基础和临床研究提供新思路和开辟新途径。

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Effect and significance of anti-CD137L monoclonal antibody on T cell subsets and cytokine induced level in aplastic anemia

Zhimin WANG1, Xuexia PAN2, Zunchang LI1,Yucun WANG3, Lipan WANG1
1. Department of Hematology; 2. Department of Pediatrics; 3. Department of Rheumatism Immunology;Binzhou People's Hospital, Binzhou 256600, China

ObjectiveTo investigate the effect of blocking CD137/CD137L signaling pathway on T lymphocyte subsets and cytokines induced by mononuclear cellsin vitro, and their roles in aplastic anemia (AA) immunotherapy.MethodsThe changes of bone marrow T lymphocyte subsets and mononuclear cells inducing cytokines (IL-2,IFN-γ, and IL-10) in AA patients before and after stimulation with anti-CD137L monoclonal antibody were analyzed by flow cytometry and ELISA.ResultsIn patients with AA, the ratio of CD3+, CD4+, CD8+ and CD25+ T cells decreased significantly after the induction of anti CD137L monoclonal antibody (P＜0.05), while the T cell subsets in control group almost had no effect. Anti-CD137L to patients with aplastic anemia bone marrow mononuclear cells of IL-2, IFN-γ levels decreased, but increased compared to normal control group (P＜0.05), which elevated IL-10 levels, but still significantly lower than the normal control group (P＜0.05).ConclusionAnti-CD137L monoclonal antibody can make T cell subsets of AA patients recover or near normal, improve the immune state, and also decrease the level of IL-2 and IFN-γ in bone marrow mononuclear cell (BMMNC), and improve IL-10 level.

Aplastic anemia; T cell; Anti-CD137LmAb; Cytokines