同型半胱氨酸试剂检测的性能验证

帅奉飞，毛万成，田敏

（思南县人民医院，贵州 思南 565100）

临床研究

同型半胱氨酸试剂检测的性能验证

帅奉飞，毛万成，田敏

（思南县人民医院，贵州 思南 565100）

目的分析探讨北京九强（循环酶法）同型半胱氨酸在贝克曼AU680全自动生化分析仪上检测的性能验证。方法依据CLSI-EP相关文件，在AU680生化分析仪上对该试剂盒的准确度、重复性、线性、灵敏度、特异性、精密度、临床可报告范围、回收实验等方面进行性能评价。结果准确度偏差＜5.48%、重复性CV＜2.09%、线性R2=0.999,6、灵敏度=0.379,6、批内精密度（CV）为1.34%、批间精密度（CV）为1.31%；线性范围1.5 μmol/L-50 μmol/L，最大稀释倍数为8，临床可报告范围1.5 μmol/L-400 μmol/L；抗坏血酸＜20 mg/dL、血红蛋白＜1,200 mg/dL、胆红素＜20 mg/dL、甘油三酯＜2,500 mg/dL，对试验无明显干扰、回收率101.7%。结论北京九强（循环酶法）同型半胱氨酸在贝克曼AU680全自动生化仪上的分析性能良好，可用于临床检测。

同型半胱氨酸；试剂；性能验证；检测

同型半胱氨酸（Hcy）是一种含基的氨基酸，主要来源于饮食摄取额度蛋氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中一个重要的中间产物，其本身并不参加蛋白质的合成。Hcy最直接的危害是损伤血管，对血管内皮产生毒素，参与动脉粥样的产生和斑块形成等，是心脑血管疾病的一个独立危险因素，高Hcy水平可以反映相关疾病的危险程度[1]近年来，随着循环酶法检测同型半胱氨酸试剂盒大量上市，我们申报的“Hcy与炎性反应的相关性”作为国家“863”计划项目的一个子课题，为了使我们实验室检测的Hcy结果更加准确可靠，本研究特对我们使用的北京九强循环酶法同型半胱氨酸在AU680全自动生化仪上检测性能进行了详细分析。

1 材料与方法

1.1 评价系统

1.1.1 仪器 贝克曼AU680全自动生化分析仪。

1.1.2 试剂 同型半胱氨酸检测试剂盒HCY批号：16-0816（北京九强生物技术股份有限公司）；校正血清：GCHCY，批号：16-0816；质控血清：GQ-HCY/2，批号：16-0418；实验基质：检验科混合血清，干扰试验材料：实验材料：VC 500 mg/dL；血红蛋白10,000 mg/dL；胆红素500 mg/dL；甘油三酯20,000 mg/dL。

1.1.3 检测原理 Hcy在Hcy甲基转移酶及S-腺苷Hcy水解酶的共同作用下循环放大，同时产生腺苷。腺苷被水解成氨和次黄苷，氨在谷氨酸脱氢酶催化下使NADH转化成NAD+，在340 nm处检测反应吸光度，其变化率与Hcy的浓度成正比。

1.1.4 检测参数 采用两点速率法，主波长340 nm，样本13 UI，R1试剂240 UI，R2试剂65 UI。

1.2 样本 本院门诊、住院患者及健康体检者的血清样本。

1.3 方法及指标判定 每天先测定2个水平质控品，按实验室室内质控规则（1.3 s、2.2 s）进行质控，在控后再进行试剂性能评价。性能评价指标：依据CLSI-EP相关文件，在AU680生化仪上对北京九强循环酶法Hcy测定试剂盒进行准确度、重复性、线性、灵敏度、特异性、精密度、临床可报告范围、回收实验等方面进行性能评价，并与试剂厂家声明的参数进行比较。

1.3.1 准确性 质控血清：GQ-HCY/2，批号：16-0418，测三次，计算其偏差，准确性偏差应不超过±10%。

1.3.2 重复性 测定检验科混合血清，重复测定20次，重复性的变异系数CV应≤10%；

1.3.3 线性 留取高值样本，按照浓度梯度1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍比稀释，重复三次，取平均值，最后做出线性曲线，要求R2≥0.99。

1.3.4 灵敏度 连续检测去离子水10次，计算测值的平均值，SD，以平均值+3＊SD对应的浓度为试剂的分析灵敏度。

1.3.5 干扰试验（特异性） 以检验科的混合血清为基质，添加干扰物后检测，在病人混合血清180 μL中分别加入甘油三酯、胆红素、血红蛋白、VC干扰物，干扰物浓度梯度为1、1/2、1/4、0，再分别测定样本值，分析添加干扰物后测量的偏差；判断标准：与平均值作比较，干扰物测值偏差不超过±10%视为无干扰。

1.3.6 精密度 连续5天测定检验科混合血清，每天测定4次，批内精密度，批间精密度，变异系数CV应≤10%。

1.3.7 临床可报告范围验证 选择高值样本，分别做不同倍数的稀释，稀释后测量值与理论值间的偏差应在±10%以内，用线性乘以最大稀释倍数得出的数值即为可报告范围上线。

1.3.8 回收率验证 用5%的高浓度样本加入到95%的低浓度基质血清中混匀检测，并计算其理论值，测量值与理论值间偏差不超过10%。

2 结果

2.1 干扰试验分析结果 见表1。

2.2 Hcy试剂在贝克曼AU680全自动生化分析仪上检测的性能验证结果 验证指标判定标准验证结果：准确性：GQ-HCY/2，批号：16-0418，靶值12.22，偏差=5.48%；重复性：检验科混合血清，重复测定20次，计算CV，CV=2.09%；线性留取高值样本，按照浓度梯度1、1/2、1/4， 1/8、1/16、1/32倍比稀释，重复三次，取平均值，做出线性曲线，求出R2，R2=0.999,6；灵敏度：水为样品检测10次后，计算均值+3SD的浓度，灵敏度=0.379,6；特异性抗坏血酸≤20 mg/dL，胆红素≤20 mg/dL，红蛋白≤1,200 mg/dL，甘油三酯≤2,500 mg/dL，对HCY均无影响，偏差不超过±10%，血各项偏差都在±10%以内；精密度：连续5天测定检验科混合血清，每天测定4次，批内、批间精密度的变异系数CV应≤10%，批间精密度CV=1.31%；临床可报用高值样本，分别做不同倍数的稀释，稀释后临床可报告测量值与理论值间的偏差在±10%以内的最大稀释倍数乘以线性得出可报告围上线，稀释后临床可报告范围为：1.5 μmol-400 μmol；回收率：以5%的高浓度样本加入到95%的低浓度基质血清中混匀检测，并计算其理论值，测量值与理论值间偏差不超过10%，回收率为：101.73%。

表1 同型半胱氨酸循环酶法干扰试验因素分析

2.3 结论 根据CLSI-EP相关文件及国家卫生行业有关判定标准[2]，同型半胱氨酸检测试剂盒（北京九强）各项性能指标符合标准要求，性能验证通过。

3 讨论

Hcy为含巯基氨基酸，是胱硫醚和蛋氨酸转硫化和甲基化代谢旁路中形成的中间体。80%的Hcy在血中通过二硫键与蛋白质结合，只有很少一小部分游离Hcy参加循环。自20世纪60年代初在尿中首次被发现以来，Hcy被认为与多种先天性代谢缺陷有关，如胱硫醚β合成酶缺乏是已知的造成高同型半胱氨酸尿症的原因。

最近，人们又发现高同型半胱氨酸血症是发生外周血管、脑血管和冠状动脉血管疾病的危险因素之一。随着研究的深入，血浆Hcy作为心脑血管病尤其是脑卒中的独立危险因子的地位已经得到确立。鉴于我国脑卒中发病率（250/10万）明显高于国外，故有学者提出了“H”型高血压的概念，强调在控制血压的同时，还要控制高同型半胱氨酸血症。国外的HOPE-2再研究已确认叶酸预防脑卒中有效，其中65%的患者合并了ACEI类药物使脑卒中风险显著下降25%。国内亦有学者使用依那普利加叶酸片控制伴有Hcy升高的高血压病患者，并取得良好效果。

由实验结果可知，Hcy批内精密度（CV）为1.34%，批间精密度（CV）为1.31%远低于国际公认质量标准（允许精密度小于6%）[3]，用高值样本进行倍比稀释上机检测求R2=0.999,6，高于卫生行业标准的0.995要求，故完全能满足性线要求。在做回收实验时发现，最开始定标是用的北京九强Hcy试剂盒自带的两点定标校准品进行校准后，做回收实验，计算出回收率都在200%左右，向厂家提出要求解决，最后通过分析可能是由于定标原因，及时更换了六点定标液，由以前的两点定换成了六点定标，再做回收试验，其结果为101.73%，回收试验在可控范围内，参照文献分析其原因[4]，两点定标检测结果比多点定标检测结果比较，用两点定标曲线检测的结果偏差较大，不能满足检测要求。两点定标和多点定标的区别在于，两点定标曲线是一条直线，而多点定标则是一条曲线，做回收试验低值标本和高值标本混合后检测，导致两种定标方法所做结果差异较大。故将该试剂盒换成六点定标后的批内精密度、批间精密度、线性和回收率均达到要求[5]。

循环酶法是目前临床测定血清Hcy最新的一种化学方法，与以前免疫、电泳、色谱等方法相比，更具有操作简单，灵敏度高，线性范围宽，抗干扰因素强，精密度较好，可自动化等优点，随着对同型半胱氨酸的临床研究的深入，其定量测定意义越来越受到重视，因此本实验采用一系列较为简化且合理的方法对其进行方法学评价[6,7]，为保证检测结果的正确可靠有着十分重要的临床意义。

[1]闫慧慧, 罗金刚, 骆飞, 等. 国产循环酶法检测同型半胱氨酸试剂盒的分析性能评价[J]. 检验医学与临床, 2016, 8(13):2272-2275.

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国家高技术研究发展计划（863计划）（No.2014AA022304）