血管内皮生长因子在神经病理性疼痛中作用的研究进展

张 慧 申 文

（1徐州医科大学，徐州221000；2徐州医科大学附属医院疼痛科，徐州221000）

神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是由躯体感觉系统的损害或疾病所产生的疼痛[1]。机体由于机械性创伤、代谢障碍疾病、神经毒性化学物质、脊髓损伤等造成体感神经系统发生结构和功能改变，在应对伤害性和非伤害性刺激时，疼痛感受被病理性放大，由此引发神经病理性疼痛。人类血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) 家族在1983年被发现，最初被命名为血管通透性因子(vascular permeability factor, VPF)，是调节血管生成和血管通透性的关键因子。近十几年来，VEGF家族对神经细胞的作用被广泛研究，尤其是 VEGFA (vascular endothelial growth factor A, 血管内皮生长因子A)在神经系统中表达最为丰富，是其中最重要的家族成员[2,3]，参与神经系统发育和功能发挥的多个环节。其他VEGF家族成员在中枢神经系统中的表达和功能尚不清楚。VEGF受体(VEGF receptors, VEGFRs)中VEGFR2表征良好，在神经系统中参与多种神经细胞的迁移、增殖、存活过程，介导VEGFA在神经细胞中的信号转导[4]。VEGF是神经与血管之间密切联系的关键因子，在神经系统具有多效性，参与多种疾病的病理过程。越来越多的学者开始关注VEGF在神经病理性疼痛治疗领域的潜力。本文将简要综述VEGF参与神经病理性疼痛的相关研究最新进展，期待随着国内外研究的深入，这一研究方向可为开发新型镇痛药物和疼痛治疗提供新思路。

1. VEGF结构与功能

VEGF是广泛存在于组织中高度特异的血管内皮细胞有丝分裂原，属于胱氨酸结生长因子超家族，由五种结构相关的二聚体糖蛋白，VEGFA，VEGFB，VEGFC，VEGFD及胎盘生长因子(placenta growth facor, PlGF)组成，通过结合酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinases, RTKs) VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3发挥生物学效应。蛋白水解VEGFA（以下简称VEGF）可产生各种具有不同生物学活性的异构体，因成熟蛋白质中末端氨基酸残基的数量不同，人类主要为VEGF121，VEGF165和VEGF189三型，VEGF165是在正常组织及肿瘤中表达最多的一型[5]。人类的vegfa基因包含8个外显子和7内含子。外显子特定剪接后产生两种蛋白亚型：通过近端剪接位点(proximal splice site, PSS)产生经典的VEGFxxxa，可促进血管生成；而最近研究较多的是通过远端剪接位点(distal splice site, DSS)产生可抗血管生成的VEGFxxxb。这个过程产生的两个多肽家族具有相同的大小，二聚化和受体结合域保持一致，仅C-末端序列不同[6]，这种构象上的差异，导致VEGFxxxb无法绑定VEGFR2的复合受体神经纤毛蛋白 (neuropilin-1, NRP1)，并被认为是造成下游信号差异的原因。

VEGF主要结合特异的酪氨酸激酶受体VEGFR1和 VEGFR2，并通过下游 Src、PLCγ、PI3K和MAPK四条胞内信号转导通路发挥生物学效应（VEGFR3不属于主要受体）。生理条件下，神经系统中的VEGFR1和VEGFR2的表达位置不同。VEGFR2是促进神经前体细胞、分化的神经元细胞有丝分裂的主要受体，而VEGFR1则为促进胶质发育及存活的主要受体。两者都介导VEGF诱导的神经保护以及成年视网膜中Müller胶质细胞的存活过程。VEGFR2是性质最为明确的VEGF受体，介导绝大部分VEGF的分子应答，广泛分布于中枢和外周神经系统[7]。VEGF对VEGFR1的亲和力远高于VEGFR2，但VEGFR1-VEGF复合物的信号转导效应很弱，因此VEGFR1常被认为在竞争性结合VEGF后，作为“诱饵受体”降低VEGFR2在促血管生长方面的生物活性[8]。VEGF与VEGFR2结合后，促进受体二聚体形成，从而进一步通过细胞膜基部免疫球蛋白样结构域间的交互作用增强稳固性，使胞内酪氨酸残基磷酸化作用得以发生。现已有大量研究证实，在神经系统中，VEGF可直接作用于神经细胞，参与多种疾病的病理过程，例如帕金森症[9,10]、阿尔茨海默病[11,12]；化疗[13～15]、糖尿病[16,17]引起的周围神经病变；以及缺血性脑病[18,19]、脊髓损伤[20～22]等。

2. VEGF与神经病理性疼痛

（1）机械性创伤导致的神经病理性疼痛

多种外伤动物模型可模拟人类神经病理性疼痛的表现，产生痛觉过敏、触诱发痛、持续性痛等行为学表现。而VEGFRs表达于多种细胞，包括神经元、小胶质细胞/巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞及星形胶质细胞。通过与复合受体神经纤毛蛋白相互作用，VEGF可影响神经细胞的功能和发育，构成治疗神经外伤的基础，从而减轻外伤性神经病理性疼痛。此外，有研究表明轴突重生趋向于沿血管发生，因此促进损伤后血管生长有利于为轴突重生提供生长框架。有研究发现大鼠脊髓背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)和脊髓背角的VEGFR2，P2X2/3受体存在共表达，且在神经慢性束窄性损伤(chronic constriction injury, CCI)大鼠表达上调。CCI大鼠鞘内给予VEGF抗体后行为学表现与假手术组无明显差异，DRG中P2X2/3受体明显减少（Lin等，2010）；而鞘内给予VEGFR2抑制剂瓦他拉尼(Vatalanib)于CCI大鼠，大鼠DRG中P2X2/3受体、VEGF和VEGFR2 mRNA相对水平同时降低，机械缩足阈值和热缩足潜伏期都明显增高，提示DRG中VEGFR2的减少可能抑制了P2X2/3的活动，从而缓解模型鼠的疼痛行为（Liu等，2012；Li等，2012）。P2X受体为三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)门控离子通道，表达于神经元、肿瘤细胞及免疫细胞等多种细胞。嘌呤能信号通路经P2X受体作为疼痛信号转导的重要通路近年来得到了大量关注。上述研究表明，VEGF/VEGFR2与P2X2/3受体在神经病理性疼痛的发生过程中存在协同作用，VEGF可作为促炎性神经肽参与嘌呤能信号的增强从而影响疼痛。Kiguchi等[23]通过部分坐骨神经结扎 (partial sciatic nerve ligaion, PSL)小鼠实验，发现VEGF在受损神经周围表达上调，并延长小鼠疼痛行为学表现，提示在神经受损时VEGF信号通路是发生外周敏化从而诱发神经病理性疼痛的基础。Lee等[24]发现VEGF可促进坐骨神经损伤大鼠模型脊髓再生，减轻机械痛行为，促进神经功能恢复。而在外周神经损伤 (partial saphenous nerve injury, PSNI) 小鼠实验中，VEGF165b与VEGFR2结合后通过激活MEK1/2通路，对DRG神经元起保护作用（Beazley等，2013）。综上，VEGF/VEGFR2与机械损伤相关神经病理性疼痛密切相关，但关于VEGF是否发挥镇痛效应，上述实验得出了不同的结论。Hulse等[25]针对这些矛盾的实验结论，使用正常大鼠实验，发现在外周局部阻滞VEGFR2导致正常大鼠痛觉异常，腹腔注射VEGFR2抑制剂亦显著降低正常大鼠机械缩足阈值。进一步腹腔给药于坐骨神经部分损伤 (partial sciatic nerve injury, PSNI)模型大鼠后发现，VEGF165b发挥抗机械痛敏效果，模型鼠双侧痛觉迟钝，而VEGF165a不仅加剧术侧机械痛敏，更诱发双侧热痛觉过敏。外源性VEGF165a不能引起TRPV1 (Transient receptor potential Vanilloid receptor 1, TRPV1) 敲除小鼠产生机械痛敏，拮抗TRPV1受体可逆转外源性VEGF165a导致机械缩足阈值降低。在原代培养的DRG神经元中加入TRPV1拮抗剂辣椒素 (Capsaicin)，胞内钙离子增加，并且钙内流可被VEGF165a加强，但加入PKC抑制剂后这种加强效应被抑制。TRPV1是一种多觉型感受器，是无脊椎动物感觉转导，如触觉、嗅觉、光传导和温度感知，必需的一类辣椒素受体，在哺乳动物中可被热和质子激活，并导致大量阳离子内流，细胞极化发生，从而产生动作电位，在机体炎症和损伤时敏感性增强且表达上调。然而有研究指出，活性丝氨酸-精氨酸激酶1(serine-arginine protein kinase, SPK1)使剪切因子SRF1活化，与pre-mRNA近端剪接位点的选择，共同导致可变剪切产生VEGF165a而且非VEGF165b（Amin等，2011）。使用SRPIN340阻滞SRPK后，DRG神经元中VEGF165a mRNA的表达降低，SRSF1的激活水平下降，PSNI造成的大鼠机械痛敏行为得以缓解。抑制剪切因子激酶SRPK1可控制VEGF异构体的可变剪切过程，并可预防神经病理性疼痛的发生[26]。上述实验表明，VEGF165b可能发挥镇痛效应，而VEGF165a可能通过PLC/PKC通路诱发痛觉过敏，且对疼痛调节过程中可能有TRPV1的参与。控制pre-mRNA的剪切过程可能得到不同的实验结果。

（2）神经毒性化学物质导致的神经病理性疼痛

多种抗肿瘤的化疗药物具有神经毒性，并导致化疗性周围神经病变(chemotherapy-induced peripheral neuropathy, CIPN)。这些药物作用于感觉神经，造成持续性疼痛和功能障碍，包括外周神经损害，感觉缺陷、步态障碍或严重的神经病理性疼痛[13,14]，其中感觉症状最常见，例如麻木感（皮肤感觉异常）、刺痛感、跳痛及灼烧感。除非减量或停用抗肿瘤药物，否则CIPN难以预防与控制。临床上，anti-VEGF (receptor) 制剂联合化疗药物在原代培养的DRG神经元中加入化疗药物奥沙利铂后造成细胞毒反应，而VEGF165b通过激活VEGFR2和MEK1/2通路，抑制凋亡因子天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3 (caspase-3, AC3)，保护神经元免受化疗导致的神经毒性作用（Beazley等，2013）。此外，VEGF通过激活VEGFR2通路，降低Hsp90去乙酰化水平，从而升高抗凋亡因子Bcl-2，保护背根神经节感觉神经元，减轻紫杉醇造成的化疗相关神经病理性疼痛大鼠神经病变的产生（Verheyen A等，2012，2013），神经元VEGFR2过表达可减少紫杉醇诱发的小鼠外周神经病（Verheyen A，2013）。Vencappa等[15]研究发现，VEGF可预防顺铂造成小鼠感觉神经退行性改变，从而减轻模型小鼠的疼痛行为。由此可见，VEGF/VEGFRs可发挥内源性神经保护作用。临床上，anti-VEGF (receptor)联合化疗药物可使肿瘤病人生存时间延长，但由于VEGF作用于多种神经细胞，起神经保护、神经滋养作用，可诱发或加剧用药者感觉神经病变，因此，应严格监测长时间接受anti-VEGF (receptor)治疗的病人。

（3）代谢障碍疾病导致的神经病理性疼痛

糖尿病神经病理性病变时，外周运动神经、感觉/自律神经轴索发生退行性改变，导致病人出现肌无力、麻木、疼痛[16]等症状，同时机体血管基底膜增厚，血管-神经屏障崩解。VEGF在神经病变时增加神经滋养血管，从而营养外周神经轴索。然而作为神经保护和神经滋养因子，其神经重生、促功能恢复的功能也引起了大量关注。模型鼠双侧胫前(tibial anterior, TA) 肌肉通过电基因转移法注入VEGF165质粒后，伤害性感受阈上升两周后降至正常水平，且未发生毒性副作用。VEGF165质粒注入单侧TA肌肉，双侧后肢的感觉迟钝表现被逆转，且经证实这并非神经内皮血管的直接效应（Murakami等，2006）。有研究人员将锌指蛋白转录因子(zinc fi nger protein-transcription factor, ZFPTF) 应用于糖尿病相关神经病理性疼痛大鼠模型，增加 VEGF三个主要亚型（VEGF121，VEGF165，VEGF189）的内源性表达，发现DRG中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Ser/Thr kinase, AKT)磷酸化水平升高，模型大鼠的触诱发痛行为减轻，VEGF有神经保护效果（Pawson等，2010）。也有研究发现，在糖尿病模型神经病变过程中，高血糖早期通过损伤施万细胞源VEGF/FLT-1信号通路影响神经轴突生长，并且施万细胞分泌VEGF产生的中和作用发挥神经保护效果（Taiana等，2014）。Hulse等[17]发现VEGF165b治疗Ⅰ型糖尿病模型大鼠时，可明显逆转大鼠病理性疼痛行为，降低被高血糖诱发的感觉神经元AC3高活化水平，减少表皮感觉神经纤维丧失及坐骨神经畸形改变。在离体高糖环境中，永生化感觉神经元中瞬时受体电位锚蛋白1 (transient receptor potential ankyrin 1, TRPA1) 介导的钙离子活动增强，外周神经末梢TRPA1敏化。虽然TRPA1的具体功能仍有争议，但其在外周伤害感受器中作为增敏剂通道，常造成疼痛的发生，如机械性、化学性痛，尤其是高糖状态下内源性代谢产物导致的疼痛。研究者认为，VEGF165b抑制高糖环境中TRPA1增强的钙离子内流从而减少神经元损伤，同时抑制外周神经末梢中和TRPA1活化造成的机械痛敏和热痛敏，可能是其抗伤害性感受的机制。由此可见，VEGF165不仅可以通过促血管生成，改善组织血供，减轻糖尿病造成的多发神经病变，同时也可通过非血管效应改善糖尿病模型鼠的感觉障碍。其中VEGF165a发挥经典的促血管生成效应，而VEGF165b发挥抗血管生成功能，因此合理控制二者比例，持续小剂量释放VEGF或许可改善糖尿病病人的感觉性多发性病理性改变。

（4）脊髓损伤导致的神经病理性疼痛

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)触发多种机制造成神经元兴奋性发生永久性改变，成为潜在的伤害感受信号，构成疼痛发生的基础。为了区分生理性改变及细胞病理性变化，脊髓损伤常被分为两个阶段：原发损伤，指脊髓受到的最初的机械创伤，而继发性损伤指在原发伤后1分钟到6个月内发生的一系列病理改变。尽管原发伤引发了一系列的改变，但炎症、缺血、脂质过氧化、自由基的产生、离子通道的破坏、细胞坏死和凋亡等SCI相关损伤和变性过程常发生于继发性损伤阶段。SCI后脊髓组织继发的炎症及血管崩解对运动神经元的存活及功能恢复起到关键作用。血流灌注减少、大量失血、低血压、微循环和血-脊髓屏障 (blood-spinal cord barrier, BSCB) 被破坏，组织结构丧失，最终加重了创伤后细胞损伤。大量实验表明，VEGF及VEGFRs在脊髓和脑损伤后于多种细胞中表达，因此，研究者常认为VEGF介导的血管生成和神经保护有利于CNS损伤后的修复。但迄今为止，SCI后VEGF相关的促血管生成治疗是否有益仍存在争议。在SCI后使用VEGF处理模型动物，研究者们得出多种结论。

有研究发现大鼠SCI模型内源性VEGF165水平降低（Herrera等，2009）。Figley[20]等发现SCI大鼠凋亡细胞遍布脊髓灰质、白质，凋亡最严重处位于受损部位，VEGF165并不能产生最佳的神经保护或促血管生成效果。使用VEGF触发的锌指蛋白(VEGFA-activating zinc finger protein, AdV-ZFPVEGF)增加大鼠体内VEGF各型的表达(VEGF120，VEGF164，VEGF188)，模型大鼠细胞水平和分子水平表现，包括血管数量增加，新生血管增加，凋亡减少，神经元增加等都得到了明显的改善。此外，模型鼠后肢承重增加，触诱发痛明显减轻，对疼痛的忍耐度显著提高。另有研究者使用低氧诱发SCI大鼠增加VEGF表达，发现VEGF表达增加起到神经保护效果（Choi等，2007）。慢性压迫脊髓损伤模型4周后，VEGF在星形胶质细胞表达上调，且4-6周模型动物功能恢复显著（Del等，2009）。通过腺病毒编码VEGF165用于部分脊髓横断模型，模型鼠损伤部位血管数量显著提升，皮质脊髓束轴突逆行变性减少（Facchiano等，2002）。有研究通过脐带血单核细胞增加小型猪脊髓损伤模型的VEGF表达，从而发挥神经保护效果，增加受损神经元的存活率[21]。在大鼠脊髓损伤模型，使用PLGA微球增加VEGF的释放，可促进血管生成，增加神经前体细胞向损伤部位的聚集。同时，刺激脊髓损伤SCI大鼠轴突生长，减小白质丧失体积，加快神经修复[22]。然而，有研究者在SCI后3天于脊髓挫伤部位直接注射2 μg VEGF165，导致损伤范围扩大，感染加重 (Benton，2003)。VEGF165可增加 SCI大鼠背角中的有髓纤维，增加神经丝蛋白，加剧SCI模型大鼠的触诱发痛，而中和VEGF165却不能减轻大鼠的疼痛。研究者分析或许是其他的VEGF亚型（如VEGF188）激活了同一通路，造成SCI后疼痛（Nesic等，2010）。关于VEGF在SCI中的作用，在多个原因可解释这些看似矛盾的实验结论。首先，不同研究的给药方式存在差异。Figley等直接向受损脊髓注射VEGF165，而Facchiano等人使用Matrigel基质胶包裹蛋白后植入切口腔中，此法可能降低肽物质向薄壁组织的释放效率，且此前有研究表明，VEGF加入中脑外植体培养环境中可促进血管生成，而大剂量时则明显增加星形胶质细胞生成，起到神经保护和神经滋养的功能。此外，也有研究表明通过慢性输注或病毒介导的转基因表达的方式，VEGF介导新生血管的形成效应可达到最大化。其次，作为调节血管通透性的关键因子，VEGFxxx亚型众多，且VEGFxxxpre-mRNA剪切产物效应也存在差异，仅以VEGF165a和VEGF165b为例，VEGF165a可促血管生成，增加血管通透性，而VEGF165b在非促血管生成组织中高度表达，并中和VEGF165a的血管效应，在肿瘤及其他异常血管生成病理过程中表达下调，抑制血管生成过程。因此，不同实验中，VEGFxxxmRNA剪切体及蛋白表达比例的差异也可能造成研究结果不同。

3.小结与展望

近年来，大量研究表明VEGF/VEGFR可从外周和中枢层面参与影响正常动物和多种神经病理性疼痛动物模型的行为学表现。VEGF是通过何种机制的哪些环节参与神经病理性疼痛的，仍有待于进一步研究。关于VEGF在神经病理性疼痛动物实验中发挥的作用仍存在争议：其治疗效果包括促血管生成，神经滋养，保护、修复血管，减少细胞凋亡，使组织免受缺血损伤等；其负性效果包括增加血管通透性，造成组织水肿等。由上述研究中我们可以看出，在神经病理性疼痛的环境中，VEGF pre-mRNA剪切体之间平衡关系是调节神经元性质和行为的基础，控制pre-mRNA的剪切过程对控制疾病发展的十分关键。而关于剪切机制及其下游信号的报道很少，原因之一在于要定量VEGFxxxmRNA和蛋白质的表达十分困难。另外，VEGFxxx特异抗体仍未上市，针对不同亚型ELISA的敏感性也没有得到验证。因此，仍需要发现合理的方法，对不同亚型进行准确定量，以提高治疗效率。目前已有anti-VEGF (receptor) 制剂因其抑制肿瘤血管生成作用被批准上市，用于治疗一系列癌症的治疗，若其同时通过相应潜在途径缓解疼痛，可作为抗癌镇痛药物为肿瘤病人带来福音。然而，有关VEGF/VEGFR于疼痛领域的研究仅限于临床前动物实验，临床研究报道较少，且其神经营养活性的实验基础建立在可促进外周神经微循环的神经血管新生的治疗潜力上。相信随着国内外研究的深入，更多特异性佳、副作用小的制剂将会为神经病理性疼痛的治疗开辟新的天地。

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