生物有机肥对压砂西瓜促生防病效果及土壤微生物区系的影响

康萍芝，张丽荣，杜玉宁，白小军，张治科

（宁夏农林科学院植物保护研究所/宁夏植物病虫害防治重点实验室，宁夏 银川 750002）

宁夏中部干旱带压砂西瓜地多年来由于压砂地严重缺水、轮作困难而连茬种植，加之生产上长期和大量使用化肥和化学农药，导致压砂地肥力衰退、土壤老化、盐碱化、产品品质明显下降、枯萎病等土传病害和连作障碍等问题非常严重，使压砂瓜产业的可持续和健康发展面临着严峻的考验和挑战。

生产中轮作、培育抗病品种、砧木嫁接等非化学防控措施经常被推荐用于控制枯萎病等土传病害，这些技术措施虽然效果明显，但由于自身存在着某些缺点导致在生产中难以实施或大面积推广应用，而施用生物有机肥目前被认为是一种可持续的生物防控土传病害的新途径。许多研究表明，生物有机肥除了有促进作物生长、提高产量［1-3］和改善品质的作用外［4-9］，还有减少和缓解因连作而导致的土传病害的作用［10-13］。本试验以压砂西瓜枯萎病为靶标对象，采用室内稀释平板涂抹法、Biolog-ECO微平板法和田间穴施方法，探讨了施用生物有机肥对压砂西瓜的促生长作用、枯萎病的防控效果及对土壤微生物区系和群落功能多样性的影响，筛选出了防控压砂西瓜枯萎病或减轻连作障碍的生物有机肥最佳用量和有效方法，为解决我区压砂瓜连作障碍瓶颈问题提供重要的理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试肥料：馕播王复合微生物肥或生物有机肥（江苏省江阴市联业生物科技有限公司生产）有效活菌数（CFU）≥0.20亿/g、有机质（以干基计）≥40.0%、游离氨基酸（以干基计）≥0.70%、总养分（以干基计）10%～15%、pH 5.5～8.5；金菌冠微生物菌剂（山东金正大生态工程集团股份有限公司生产）有效活菌数≥5.0亿/g、有机质≥45.0%，特别添加黄腐酸钾。

供试作物为压砂西瓜，品种为金城五号。

供试土壤为连作12年的老压砂西瓜地，土壤肥力差。土壤理化性状为：pH值8.0、全盐0.66 g/kg、有机质5.22 g/kg、全量氮0.39 g/kg、全量磷0.51 g/kg、全量钾22.9 mg/kg、速效氮80 mg/kg、速效磷8.12 mg/kg、速效钾132 mg/kg。

供试培养基均使用选择性培养基，分离培养细菌用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、真菌用马丁氏琼脂培养基、放线菌用改良高氏1号培养基、尖孢镰刀菌使用Komada选择性培养基测定。

主要仪器设备：立式电热蒸汽压力灭菌锅；干燥箱；空气浴培养摇床；超净工作台；霉菌培养箱；电子天平等仪器设备。

1.2 试验方法

试验于2016年在宁夏中卫市香山乡红圈子村三合队进行，选择连作12年的西瓜压砂地进行田间试验，试验设馕播王生物有机肥100、200、300、400 g/穴和金菌冠微生物菌剂100 g/穴、单施基质200 g/穴（处理1～处理6）及常规种植施肥（CK）7个处理，每个处理3次重复，试验地种植管理水平和条件相同。

施肥采用穴施方法，先挖20 cm×30～50 cm×20～30 cm的坑穴，再将馕播王生物有机肥撒入坑内与土拌匀，尽可能往下翻至30 cm，然后覆土覆砂。

采用五点取样法，分别对不同处理压砂瓜根围土壤进行取样，挖开砂采集土壤深度为0～15 cm，将不同位点的土样混匀后装入保鲜袋内密闭，带回试验室内进行土壤微生物种类分离和数量测定。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 生长指标和产量测定 施肥后于生育期内使用卷尺和游标卡尺测定压砂西瓜主蔓长、茎粗、叶片数等生长指标，每个处理测定株数为30株；收获期测定整个试验小区的产量，并计算其增产效果。

1.3.2 病害发生情况调查 重点调查整个试验小区压砂西瓜生育期内的死苗、枯萎病发生情况，并计算其死苗率、病株率和相对防效。

1.3.3 土壤样品理化性状测定 测定指标包括土壤pH值、有机质、全盐、全量氮、全量磷、全钾、速效氮、速效磷、速效钾等。其中，土壤 pH值测定采用酸度计；全盐测定采用电导率法；有机质测定采用重铬酸钾滴定法；全量氮测定采用凯氏定氮法；速效氮测定采用扩散吸收法；全量磷、速效磷测定采用分光光度计法；全钾测定采用原子吸收分光光度法；速效钾测定采用火焰光度法。

1.3.4 土壤微生物区系及病原菌数量测定 采用平板涂抹法。土壤悬液制备及分离方法：取10 g西瓜根部土壤样品，倒入装有100 mL灭菌水的150 mL三角瓶中，放入摇床上振荡15min后静置，再稀释成102、103、104、105、106倍的土壤悬液，取0.2 mL加入到已凝固的选择性培养基平板上涂抹均匀，然后置于25℃恒温培养箱内培养5 d左右，观察菌落出现情况，分别调查土壤中细菌、真菌、放线菌及尖孢镰刀菌的数量。细菌使用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；真菌用马丁氏琼脂培养基；放线菌用改良高氏1号培养基；西瓜枯萎病菌（尖孢镰刀菌）采用Komada选择性培养基。

1.3.5 土壤微生物群落功能多样性测定 采用Biolog-ECO微平板法。称取10 g鲜土（称量前测量含水量），加入90 mL无菌生理盐水中稀释，在摇床里振摇30 min，静止沉淀3～5 min，然后进行100倍稀释，以每孔150 μL稀释液加入微孔板中，将制备好的菌悬液倒入无菌移液槽中，使用八孔移液器将其接种于微平板的96孔中。接种好的微平板放到铺有六层纱布的塑料盒中，为防止微平板鉴定孔中的菌悬液挥发，纱布保持一定的湿度。塑料盒用保鲜膜包裹，保鲜膜上用注射针头扎若干个小眼，以保证微生物的培养所需要的氧气，将微平板避光培养。

1.4 数据分析方法

使用Excel 2003和SPSS 13.0软件对数据进行处理，利用 Duncan's 法进行数据方差分析；采用Biolog微平板培养96h的数据进行数据统计，利用Excel和 DPSv3.11、CANOCO软件对ECO板结果进行统计分析。孔的平均颜色变化率（AWCD）计算方法如下：

式中，C为处理每个碳源孔的光密度值；R为对照孔的光密度值；n为培养基碳源种类数。

通过丰富度、多样性指数、均匀度指数和优势度指数等来表征土壤微生物群落的功能多样性，并分析其差异显著性；将BiologGN2微平板中的氨基酸类、糖类、羧酸类、聚合物类和多种碳源等物质进行主成分分析（PCA），以便了解土壤微生物的主要类群。

2 结果与分析

2.1 穴施生物有机肥对压砂西瓜生长指标、产量的影响及枯萎病防效测定

从表1、表2可以看出，单施不同用量生物有机肥对西瓜有明显促生长作用，与金菌冠微生物菌剂、常规施肥（CK）相比，各处理西瓜死苗率有所降低，主蔓长、叶片数、分枝数、茎粗均显示出明显优势，差异显著，对枯萎病的防效达77.21%～88.73%，增产率达14.7%～26.8%，其中处理2、处理3、处理4效果比较明显，产量差异显著，防效高。

表1 穴施生物有机肥对压砂西瓜死苗率、生长指标及枯萎病防控的影响

表2 穴施生物有机肥对压砂西瓜产量的影响

图1 生物有机肥对压砂西瓜土壤微生物区系及尖孢镰刀菌数量的影响

2.2 穴施生物有机肥对压砂西瓜土壤微生物区系及尖孢镰刀菌数量的影响

试验结果（图1）表明，施以不同用量的生物有机肥后，压砂地土壤微生物区系发生不同程度变化，其中真菌数量处于先下降后缓慢上升趋势，细菌、放线菌呈上升趋势，尖孢镰刀菌呈下降趋势，且各施肥处理均好于对照生物菌肥、单施基质和常规对照，尤其是金菌冠微生物菌剂处理效果较差。

2.3 穴施生物有机肥对压砂西瓜土壤微生物群落功能多样性的影响

采用Biolog方法进行单施生物有机肥对土壤微生物群落功能多样性的影响测定。结果表明：随着培养时间的延长，施用生物有机肥处理后，压砂西瓜土壤微生物群落利用全部碳源和羧酸类、碳水化合物、氨基酸、羧酸等6种碳源总体呈上升趋势，其中处理1～处理4高于CK，而处理5、处理6低于CK（图2、图3），说明施用生物有机肥后土壤微生物群落对全部碳源的利用能力较高，微生物代谢活性较强；不同处理对土壤微生物群落功能多样性指数的影响也存在一定的差异性（表3），物种丰富度、优势度指数、多样性指数均有所上升；从样品主成分分析的散布区域（图4）可以看出，处理2～处理4处于同一区域内分布相对集中，相似度较高，对碳源的利用能力比较强，而其余处理土壤样品分布差异较大。

图2 不同处理对压砂西瓜土壤微生物利用全部碳源的AWCD值

图3 不同处理对压砂西瓜土壤微生物利用6种不同碳源的AWCD值

表3 不同处理土壤微生物群落功能多样性指数

3 结论与讨论

西瓜枯萎病是西瓜生产中较难防治的一种土传病害。多年来，国内外许多专家学者都在寻找防控西瓜枯萎病的有效途径，而生物有机肥以其独特的优势成为目前生物防治研究的热门和安全、环保的生防措施。本研究通过两年的田间多点试验，筛选出了有效防控压砂西瓜枯萎病或减轻连作障碍的生物有机肥最佳用量，建议连作10年左右的老砂地，西瓜苗根部穴施生物有机肥适宜用量为200～300 g/穴；而连作5年左右的新砂地，西瓜苗根部穴施生物有机肥适宜用量为140～200 g/穴；若在坑内苗旁施用生物有机肥，可加大用量至400 g/穴。

图4 不同处理土壤微生物群落功能多样性主成分分析

同时，研究结果也表明，施用生物有机肥可显著提高压砂西瓜根部土壤有益微生物的数量，且对压砂西瓜植株具有明显的促生长作用和防病效果。本试验施用不同用量的生物有机肥后，土壤中细菌和放线菌的数量显著增加，尖孢镰刀菌数量显著减少，真菌数量先减少后缓慢增加，且施肥量越大，效果越明显；施用生物有机肥还可对压砂西瓜产生明显的促生长作用，这一结果与凌宁等［14］的研究结果相似。另外，施用生物有机肥也对西瓜枯萎病具有一定的防控效果，具体表现为可延迟西瓜发病时间，病株率降低，提早成熟期7～10 d，且随着生物有机肥施用量的增加，防病效果越好。

土壤微生物区系失去平衡是作物连作产生障碍的主要因素之一。因此，在研究克服连作障碍的施肥过程中，不仅要抑制土传病原菌的数量，而且要提高有益细菌和放线菌的数量［15－16］。本试验结果表明，施用生物有机肥可以明显增加压砂西瓜根部土壤细菌、放线菌数量，大大降低尖孢镰刀菌的数量，使土壤微生物区系朝着有利的方向发展。分析其原因，主要是生物有机肥中的有益菌群可直接带入或刺激产生大量的有益微生物，而生物有机肥中添加的解淀粉芽孢杆菌、木霉等拮抗菌及其代谢产物通过竞争、重寄生、抗生等作用可抑制土壤中尖孢镰刀菌的生长，降低病原菌数量，有利地调节土壤微生态环境，从而减轻压砂西瓜枯萎病等土传病害的发生。

此外，本研究通过常规微生物平板计数和Biolog技术相结合的研究方法，能够较为真实地反映出压砂西瓜根部土壤中微生物种群数量和功能结构多样性所发生的变化，为压砂瓜枯萎病等土传病害的有效生物防治和连作障碍机理的研究提供重要的理论和实践依据。

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