同位素稀释-气相色谱-串联质谱法测定猪肉中残留的4种β-受体激动剂

岳韩笑，雷 雯，杜晓宁，许 旭

(1.上海应用技术大学化学与环境工程学院，上海 201418；2.上海化工研究院，上海稳定性同位素工程技术研究中心，上海 200062)

随着社会的发展和进步，人们对动物源性食物的需求量大幅增加，畜产品生产过程中滥用β-受体激动剂等兽药的违法行为也随之日益严重。β-受体激动剂主要包括克伦特罗(俗称“瘦肉精”)、妥布特罗、沙丁胺醇、溴布特罗等，该类化合物曾经作为药物用于治疗支气管哮喘[1]。这些药物的高合成代谢潜能使其可被用于运动学和动物饲养学，以提高肌肉合成、减少身体脂肪[2]，但大剂量的使用会导致其在动物体内残留蓄积，其在肌肉、肾脏、肝脏、肺脏中的残留蓄积量依次升高[3]，残留蓄积浓度可达100～500 ng/g，人食用了这种猪肉后可能会产生剧烈腹痛，肌肉震颤等症状[4]，因此许多国家或组织限制或禁止在食用动物养殖中使用β-受体激动剂[5]。我国针对β-受体激动剂的使用有明确的规定，农业部在2001年12月27日、2002年2月9日、2002年4月9日三次下发文件禁止将β-受体激动剂类药物作为食用动物饲料添加剂(农业部176号、193号公告、1519号条例)，但是尚未对生猪肉中“瘦肉精”的残留限量做出明确规定。现在普遍采用的是农业部第38号文件，以1 μg/kg为限。

目前国内外用于检测β-受体激动剂的方法很多[6]，如高效液相色谱法(HPLC)[7]，气相色谱-质谱联用法(GC/MS)[8-11]，液相色谱-质谱联用法(LC/MS)[12-15]等。猪肉中β-受体激动剂的残留量检测为痕量分析，样品的基质比较复杂，同位素内标的引入可以显著提高样品的回收率，消除基质的干扰[16-18]。吴平谷等[19]使用克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3、莱克多巴胺-D5作为内标，用GC-MS检测了猪肉中的10种β-受体激动剂。但目前利用同位素内标试剂的气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)测定β-受体激动剂残留量的方法还未见报道。

本工作拟选取上海化工研究院自行研制的同位素标记试剂作为内标，采用气相色谱-串联质谱法多反应监测模式(MRM)检测猪肉中克伦特罗、溴布特罗、沙丁胺醇、妥布特罗4种β-受体激动剂的残留量，并对方法的线性范围、回收率、精密度和检出限等进行考察，希望建立一种高灵敏度和高准确性的β-受体激动剂的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7000C型GC-MS/MS：美国Agilent公司产品；DC-12-OA型氮吹仪：上海安谱科学仪器有限公司产品；AR2140型电子天平：美国OhausTM公司产品；SK2200H型超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司产品；230Volt型涡旋混匀器：美国Talboy公司产品；F6/10超细匀浆机：上海弗鲁克流体机械制造有限公司产品；TGL-20B高速离心机：上海安亭科学仪器厂产品；12位SPE固相萃取真空装置：上海安谱科学仪器有限公司产品；Poly-Sery HLB SPE柱，Poly-Sery MCX SPE柱：均为德国CNW科技公司产品。

克伦特罗标准品(clenbuterol，纯度99.0%)、溴布特罗标准品(brombuterol，纯度99.0%)、妥布特罗标准品(tulobuterol，纯度99.0%)、沙丁胺醇标准品(salbutamol，纯度99%)：德国Dr. Ehrenstorfer公司产品；克伦特罗-D9(clenbuterol-D9，纯度98.1%，丰度97.7%)、溴布特罗-D9(brombuterol-D9，纯度99.0%，丰度98.8%)、妥布特罗-D9(tulobuterol-D9，纯度93.9%，丰度98.4%)：上海化工研究院研制；N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)+1%三甲基氯硅烷(TMCS)：百灵威科技有限公司产品；β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(酶活性>100 000单位/毫升)：美国Soltec Ventures公司产品；甲醇(HPLC级)：格耐博生物科技有限公司产品；醋酸铵(AR级)：江苏强盛化工有限公司产品；高氯酸(AR级)：金鹿化工有限公司产品；氨水(AR级)：上海凌峰化学试剂有限公司产品；甲苯(AR级)：江苏强盛化工有限公司产品。

1.2 标准溶液的配制

β-受体激动剂标准储备溶液：分别准确称取溴布特罗、克伦特罗、妥布特罗、沙丁胺醇标准品9.46、12.34、5.28、3.73 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解、定容，配制成0.946、1.234、0.528、0.373 g/L的标准储备液，储存于-20 ℃冰箱中，备用。

β-受体激动剂混合标准储备溶液：各取适量上述溶液于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容，储存于-20 ℃冰箱中，备用。

氘标记β-受体激动剂储备溶液：分别准确称取溴布特罗-D9、妥布特罗-D9、克伦特罗-D912.18、11.20、5.28 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解、定容，配制成1.218、1.120、0.528 g/L的储备溶液，储存于-20 ℃冰箱中，备用。

氘标记β-受体激动剂混合工作溶液：各取上述适量溶液于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容，储存于-20 ℃冰箱中，备用。

1.3 样品前处理

1.3.1样品提取 称取2.0 g经绞碎均匀的猪肉样品于50 mL离心管中，先加入8 mL浓度为0.02 mol/L、pH 5.2的醋酸铵缓冲水溶液，再加入40 μLβ-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，50 μL混合同位素内标溶液(克伦特罗-D9、溴布特罗-D9、妥布特罗-D9)，涡旋振荡1 min，然后在37 ℃及避光的条件下水浴振荡16 h。将酶解好的产物充分涡旋振荡混匀，以10 000 r/min离心10 min，将上层清液转移至另一50 mL的离心管中，加入0.1 mol/L的高氯酸，调节pH值至1，涡旋振荡1 min混匀后，以10 000 r/min离心10 min，取上层清液进行下一步净化处理。

1.3.2样品净化 用6 mL甲醇活化HLB(亲水-亲脂平衡固相柱)和MCX(混合型阳离子交换固相柱)串联的固相萃取小柱(HLB在上，MCX在下)，加入4 mL超纯水淋洗，然后将1.3.1节得到的上清液全部加入小柱，使液体以2 s/滴的速率流出。之后用4 mL纯净水洗涤上样后的固相萃取柱，抽干1 min。用4 mL 15%的氨水甲醇溶液淋洗小柱，收集洗脱液，于40 ℃水浴下氮气吹干。

1.3.3样品衍生化 向1.3.2节中制得的蒸发剩余物中加入100 μL甲苯和50 μL BSTFA+1% TMCS，在80 ℃的烘箱中加热衍生1 h，衍生后的产物用氮吹仪吹干，加入1 mL甲苯溶解，过0.22 μm孔径滤膜，待测。

1.4 GC-MS/MS条件

1.4.1色谱条件 色谱柱：毛细管柱HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)；载气：高纯He，流速1.0 mL/min；进样口温度：280 ℃；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL；升温程序：起始温度70 ℃，保持1 min，以25 ℃/min升至230 ℃，保持1 min，以25 ℃/min升至280 ℃，保持2 min。

1.4.2质谱条件 多反应监测模式(MRM)，电子轰击离子源温度230 ℃，溶剂延迟5 min，接口温度290 ℃，电子倍增器电压为1 506 V。

2 结果与讨论

2.1 样品净化

由于猪肉样品基质比较复杂，含有大量蛋白质等内源性物质，而且猪肉中β-受体激动剂的残留量检测大多属于痕量分析，所以有效成分的提取和样品净化至关重要。目前猪肉中β-受体激动剂类药物残留分析的净化方法多采用固相萃取法，文献报道的用于样品净化处理的萃取柱包括HLB[3]、SLS[19-20]、C18[4]、 MCX[13-15]等多种作用模式的固相萃取柱。由于Poly-Sery HLB可用于吸附大量油脂，Poly-Sery MCX对碱性化合物具有较高的选择性和灵敏度，而本实验中的4种目标β-受体激动剂均为碱性化合物(pKa均大于9.0)，因此分别考察了MCX、HLB、MCX和HLB串联的净化方式对猪肉样品的净化效果，结果列于表1。可以看出，样品经MCX和HLB串联柱净化后得到的4种β-受体激动剂的回收率均大于80%，明显高于单独的MCX和HLB柱，所以本实验选择Poly-Sery HLB柱在上、Poly-Sery MCX柱在下，两柱串联的方式对样品进行净化处理。

本实验还对洗脱溶剂进行了优化，分别对5%、15%、25%三种不同比例的氨水-甲醇溶液的洗脱效果进行了比较。结果显示，当氨水-甲醇浓度为5%时，沙丁胺醇的洗脱效果不理想，回收率较低；浓度为25%时，固相萃取柱上的部分杂质也会被洗脱下来，背景噪音较高，影响检出限的测定；浓度为15%时，4种β-受体激动剂的回收率均大于80%，所以本实验选择浓度15%的氨水-甲醇溶液作为样品的洗脱溶剂。

2.2 检测离子的确定

先对7种物质进行全扫描(Scan)，然后选择这7种物质的一级碎片离子峰强度最高的离子作为母离子，在碰撞室电压分别为5、15、25、35 V的条件下进行产物离子扫描，确定这7种化合物的定性和定量离子，结果列于表2。利用MRM模式在优化的色谱和质谱条件下可以有效分离溴布特罗、克伦特罗、妥布特罗、沙丁胺醇以及溴布特罗-D9、克伦特罗-D9、妥布特罗-D9等7种化合物，其离子流图示于图1；7种化合物在空白样品基质中的离子流图示于图2。结果表明，采取MRM模式可有效降低基线噪声。

表1 三种不同净化方式对4种β-受体激动剂回收率的影响Table 1 Comparison of recoveries by 3 different purification methods for 4 β-agonists

表2 串联质谱多反应离子监测模式下的检测条件Table 2 Triplequadrupole mass spectrometric parameters in MRM mode

注：1.溴布特罗;2.溴布特罗-D9;3.克伦特罗-D9;4.克伦特罗;5.沙丁胺醇;6.妥布特罗-D9;7.妥布特罗图1 4种β-受体激动剂标准品及3种内标标准品在Scan(a)和MRM(b)模式下的衍生物离子流图Fig.1 Ion current chromatograms of the derivatives of 4 β-agonists and 3 internal standards in Scan (a) and MRM (b) modes

注：各数字代表的化合物同图1图2 MRM模式下在空白样品中添加3种同位素内标和4种β-受体激动剂标准品的离子流图Fig.2 Ion current chromatograms of blank samples spiked with 3 internal standards and 4 β-agonists in MRM mode

2.3 方法学考察

2.3.1方法的线性范围 精密量取β-受体激动剂混合标准储备溶液，分别用甲醇稀释。使其中克伦特罗的浓度分别为158.00、88.00、35.20、17.60、8.80、1.76 μg/L；溴布特罗的浓度分别为122.00、67.50、27.00、13.50、6.75、1.35 μg/L；妥布特罗的浓度分别为136.00、75.50、32.30、15.10、7.55、1.51 μg/L；沙丁胺

醇的浓度分别为144.00、80.00、32.00、16.00、8.00、1.60 μg/L。分别在上述溶液中加入50 μL混合的氘标记内标溶液，依次对系列标准工作溶液进样分析，记录离子流图的峰面积。以溶液浓度为横坐标，标样和内标物的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。4种β-受体激动剂的线性方程、相关系数、检出限(LOD)及定量限(LOQ)列于表3。由表3可见，4种β-受体激动剂在1.76～122.00 μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数R2≥0.999 7。

2.3.2检出限(LOD)和定量限(LOQ) 采用向空白猪肉样品中加入目标化合物的方法，按照1.3、1.4节的方法进行样品处理和检测。以信噪比S/N≥3测得方法检出限(LOD)，以S/N≥10测得方法定量限(LOQ)。4种β-受体激动剂的LOD在0.13～0.40 μg/kg之间，LOQ在0.40～1.27 μg/kg之间。与单级GC/MS相比[19](文献中克伦特罗的检出限1.0 μg/kg、沙丁胺醇的检出限0.5 μg/kg)，本方法所得的检出限更低，并且检出限低于GB/T 22286—2008中克伦特罗、沙丁胺醇和溴布特罗的检出限0.5 μg/kg。农业部规定我国动物源食品中瘦肉精的残留限量为1 μg/kg，本方法的检出限可满足该检测要求。

表3 4种β-受体激动剂的线性方程、相关系数、检出限(LODs)及定量限(LOQs)Table 3 Linear equations , correlation coefficients(R2), limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) of 4 β-agonists

2.3.3方法回收率和精密度 在猪肉中添加高、中、低3个不同质量浓度的克伦特罗、溴布特罗、妥布特罗、沙丁胺醇标准品，每个浓度水平进行5次平行实验，考察方法的回收率和精密度，结果列于表4。结果表明，3种添加水平的回收率为92.2%～112.8%，批内变异系数(CV)为1.0%～12.6%，批间变异系数(CV)为1.9%～13.2%。利用同位素作为内标测定各物质，可以有效地减少样品在前处理、衍生化以及仪器测定过程中产生的误差，此外，同位素内标试剂的加入，可显著提高被测样品的回收率。

表4 4种β-受体激动剂的加标回收率及变异系数(CV)(n=5)Table 4 Recoveries and variation coefficients of 4 β-agonists (n=5)

3 结论

建立了同位素稀释-气相色谱-串联质谱法，检测猪肉中克伦特罗、溴布特罗、妥布特罗、沙丁胺醇的残留量。通过对样品的前处理条件和质谱条件进行优化，4种β-受体激动剂可得到有效分离，最低检出限可达0.13 μg/kg。该检测方法在回收率、精密度等方面均可满足我国相关部门对兽药残留的检测限量要求，同时也可为其他β-受体激动剂类药物的检测提供技术支持。

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