异钩藤碱保护神经系统的药理研究进展

延沁儒，王春梅

(遵义医学院珠海校区 生理学教研室，广东 珠海　519000)

茜草科钩藤属植物是中国、马来西亚、菲律宾、非洲和东南美洲等地重要的民间药材，全世界有34种，用于治疗哮喘、风湿、高热、高血压和头痛等疾病。钩藤内含吲哚生物碱、三萜类化合物、黄酮类化合物、苯酚类化合物和苯丙素类化合物；其中吲哚生物碱被认为是抗高血压、癫痫、抑郁、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的主要药效成分[1]。异钩藤碱(Isorhynchophylline,IRN)是钩藤中主要的四环羟吲哚生物碱，具有与钩藤类似的药理活性。以往的研究表明，IRN具有降血压、抑制血管平滑肌增殖、抑制心率以及抗血栓形成等心血管保护作用，且易透过内皮细胞、星形胶质细胞以及壁细胞制作的血脑屏障模型，可能是治疗中枢神经系统疾病的活性药理成分[2-3]。随着人口老龄化的日趋严重，AD、PD、脑缺血再灌注损伤的患病率逐年增高，严重危害人类健康。因此，本文主要对IRN的神经保护作用进行概述，为临床治疗中枢神经系统疾病提供参考。

1　异钩藤碱抗实验性阿尔茨海默病的药理作用机制

AD 于1907年首次被阿洛伊斯阿尔茨海默描述，在患者大脑中发现淀粉样斑块和神经原纤维缠结，是以进行性认知功能障碍、记忆减退和人格改变为临床特征的神经退行性疾病[4]。AD特征性病理学改变包括细胞外β-淀粉样蛋白(amyloid beta protein,Aβ)沉积寡聚形成的老年斑、细胞内tau蛋白超磷酸化形成的神经纤维缠结(neurofibrillarytangles,NFTs)以及突触功能异常[5-6]。针对AD的治疗，抗Aβ聚集、增强Aβ清除、减少tau蛋白磷酸化、抗氧化、抗炎等方面的药物均是研发热点。

1.1异钩藤碱拮抗β-淀粉样蛋白诱导的神经毒性Aβ是AD的起始因子，由β-分泌酶和γ-分泌酶切割淀粉样前体蛋白(amloid precursor protein,APP)产生，主要致病的是可溶性Aβ40和更为纤维化的Aβ42寡聚体，最近发现由η-分泌酶切割APP也会产生具神经毒性的Aβ1-16肽[7]。Aβ大量沉积聚集，直接损伤细胞膜诱导氧化应激，释放活性氧(active oxygen,ROS)致使线粒体凋亡、介导神经炎症反应。

一些对ROS有反应的转录因子如热休克因子-1和核转录因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)可与APP基因的启动子位点结合诱导APP表达，氧化应激通过激活氨基末端蛋白激酶(c-JunN-terminal protein kainse,JNK)途径诱导β-分泌酶活性增加，使之产生更多Aβ[8]。研究表明，IRN预处理Aβ25-35干预的PC12细胞可显著降低细胞内ROS、 丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平，谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量大大提升，显著增强抗氧化能力[9]。在D-半乳糖诱导的衰老小鼠实验中，口服IRN连续8周后，小鼠脑组织中GSH浓度明显增加，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性提高，MDA浓度下降[10]。还有研究者通过紫外、质谱、核磁共振和光谱实验等方法鉴定，发现IRN的代谢产物MO对谷氨酸诱导的HT22细胞死亡有神经保护作用[11]。

1.2异钩藤碱抑制线粒体凋亡线粒体功能障碍已被确定为AD发病机制中的早期事件，并且通过新陈代谢减少、Ca2+动态平衡破坏、ROS水平增加、脂质过氧化和细胞凋亡发挥致病作用[4]。IRN预处理能减轻 Aβ25-35诱导的神经元毒性，从而抑制线粒体凋亡通路保护神经功能[12]。研究表明，糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK-3β)的超活化诱导神经元细胞死亡，IRN可抑制GSK-3β活化，且IRN能增强环磷腺苷效应元件结合蛋白(phosphorylated-cAMP response element-binding protein,p-CREB)(Ser133)表达从而上调抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤2基因(B-cell lymphoma2,Bcl2)活性[13]。在Aβ25-35诱导的大鼠海马神经元凋亡中，IRN显著逆转Bcl-2与Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)比值和mRNA水平，并抑制细胞色素C的释放[14]。此外，众所周知，细胞凋亡需要半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate specific proteases,Caspase)家族参与，细胞色素C可介导上游的启动子Caspase-2/-8/-9/-10自身活化，使效应蛋白Caspase-3/-6/-7执行凋亡，研究证实，IRN能下调细胞内Caspase-9、Caspase-3蛋白质和mRNA水平[13-15]。

1.3异钩藤碱对tau蛋白磷酸化的影响高度磷酸化的tau蛋白(p-tau)对AD中经典的纤维聚集起关键作用，突触功能障碍和神经元死亡受其异常构象调节，近年来发现tau过表达损害轴突运输，导致线粒体分布异常，还可调节线粒体裂变/融合蛋白来损害线粒体动力学，进一步引起线粒体功能障碍和神经元损伤[16]。据报道GSK-3β在完整细胞的多个位点磷酸化tau蛋白[17]。IRN可从Thr308、Ser473位点激活磷脂酰肌醇-3 激酶 (phosphatidyl inositol 3-kinase,PI3K) /蛋白激酶 B (protein kinase B,PKB)信号通路以抑制Ser9位点的GSK-3β活化[13]。tau蛋白在Thr205、Ser396和Ser 404位点的过度磷酸化可能引起配对螺旋丝状体的聚集体和微管细胞骨架不稳定，以及诱导细胞凋亡和区域特异性神经变性，IRN可在上述几个位点抑制tau蛋白过度磷酸化，IRN对Aβ诱导的tau蛋白过度磷酸化的神经保护作用与抑制GSK-3β活性和激活PI3K /PKB信号通路密切相关[11]。

1.4异钩藤碱抑制星形胶质细胞释放炎性介质星形胶质细胞功能障碍会破坏神经元的正常生活环境，因为突触传递和信息处理失败导致与认知功能密切相关的神经回路损失，可能是认知障碍的始动因素。Aβ通过α7烟碱乙酰胆碱受体触发星形胶质细胞钙瞬时信号传导诱导星形胶质细胞活化，引起氧化应激和细胞毒性，产生趋化因子和炎症因子，随后发生神经元死亡[18]。据报道在脂多糖诱导的小鼠胸腺N9细胞中，IRN通过阻断NF-κB、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38 MAPK)等信号通路抑制如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素1β等促炎症因子的产生[19]。在原代培养的星形胶质细胞中，IRN减弱一氧化氮合酶mRNA的表达，抑制炎性介质的释放[20]。IRN能有效抑制中枢神经系统炎症反应。

2　异钩藤碱对实验性帕金森病的药理作用机制

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二大神经退行性疾病，以运动迟缓、静息性震颤、肌肉强直和位置不稳定为临床特点，病理特征为黑质多巴胺能神经元中路易体堆积[21]。α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)、钙离子和多巴胺之间的协同作用可能导致蛋白质平衡失调和神经元的选择易感性。

2.1异钩藤碱诱导α-突触核蛋白自噬α-syn是路易体的主要成分，基因组的二聚体或三聚体突变导致其过度表达，点突变(A53T和A30P)增加α-syn的聚集。易聚集的蛋白如α-syn、tau和突变型亨廷顿蛋白，在很大程度上依赖泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体途径清除[22- 23]。已证实IRN以剂量依赖型方式诱导自噬并未阻断自噬体成熟，在N2a、PC12和SH-SY5Y细胞中增加自噬微管相关蛋白轻链3-II的水平；诱导果蝇L3幼虫脂肪体自噬；通过诱导自噬促进了野生型(WT)和突变体(A53T和A30P)N2a细胞中瞬时过表达α-syn的清除。此外，IRN促进胚胎干细胞分化的多巴胺能神经元中α-syn的降解，不影响自噬激活因子Beclin 1的表达，但Beclin 1 siRNA基因被敲除时可完全阻断IRN诱导的自噬[14]。

2.2异钩藤碱拮抗1-甲基-4-苯基吡啶诱导的神经毒性1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridine,MPP+)被多巴胺转运蛋白吸收到多巴胺神经元中，通过影响呼吸链复合物I活性，在线粒体上发挥神经毒性作用[24]。细胞内抗氧化防御系统硫氧还蛋白-1(thioredoxin-1,Trx1)在硫氧还蛋白氧化还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(triphosphopyridine nucleotide,NADH)存在的情况下通过清除ROS来发挥抗氧化特性，在IRN作用下，MPP +诱导的SHSY5Y细胞中TrxR酶活性和Trx1蛋白表达增加以及显著减弱MPP +诱导的氧化型酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD+)和NAD + / NADH比率。IRN还可激活转录因子NF-E2相关因子(NF-E2-related factor 2,Nrf2)和抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)组成的Nrf2-ARE抗氧化系统，通过ARE的顺式作用序列转录各种抗氧化基因提供细胞保护作用。转录因子BTB-CNC同源体(BTB and CNC homology1,Bach1)与Nrf2竞争结合II阶段抗氧化酶启动子ARE以及Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)与簇集蛋白3(clusterin3,CLU3)组装形成泛素连接酶E3复合物以降解Nrf2，IRN可能调节Bach1和Keap1蛋白的表达，并抑制GSK-3β和酪氨酸蛋白激酶磷酸化，进而阻断Nrf2核降解，介导Nrf2核积累诱导ARE驱动基因转录并减弱体外氧化应激[25]。

3　异钩藤碱对动物脑缺血再灌注损伤的保护作用

大脑是很脆弱的器官，缺血会导致局限性脑组织坏死，快速恢复血流量是中风最重要的疗法，但是脑缺血不完全阻断30 min后再恢复正常，又会发生缺血-再灌注损伤，对内源性神经元“保护”或“修复”，减少神经元的迟发性死亡作为治疗脑缺血的潜在策略[26]。将海马切片暴露于缺氧和缺糖的培养基中8min通过电刺激跨越-突触诱导体外缺血，IRN减少了毒蕈碱受体和5-羟色胺2受体(5-hydroxytrptamine,5-HT2)介导的电流反应以及对N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)离子型谷氨酸受体具有非竞争性拮抗作用，结果表明这些生物碱通过阻止NMDA、毒蕈碱M1介导的缺血神经元损伤发挥保护作用[27]。在永久性大脑中动脉闭塞手术后，IRN改善了神经缺陷和脑水肿，减少梗塞体积，增加紧密连接蛋白claudin-5和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BNDF)表达。IRN可以通过激活PI3K/PKB信号通路，同时抑制Toll受体(Toll-like receptors,TLRs)/核因子κB(NF-κB)通路保护脑缺血再灌注诱导的神经损伤[28]。

4　异钩藤碱抗小鼠抑郁样作用的药理机制

单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)是位于线粒体外膜内的黄素酶，催化去甲肾上腺素(noradrenaline,NE)和 5-HT等神经递质和膳食胺的脱氨基，导致其功能不足引起抑郁症[29]。尾部悬吊和强迫游泳试验被广泛用于筛查抗抑郁药的活性，同时测定IRN对单胺类神经递质水平和MAO活性的影响来探索其作用机制。以10、20、40 mg/kg IRN灌胃7d的小鼠在强制游泳和尾部悬浮测试中不动的时间呈剂量依赖型减少，而IRN在旷场测试中不刺激小鼠运动活性。此外，IRN治疗拮抗利血平诱导的上睑下垂，低温和抑制小鼠运动活性并显著增加NE和5-HT水平以及抑制小鼠海马和额叶中MAO-A的活性。这些结果表明，IRN通过抑制MAO发挥部分抗抑郁样作用[30]。

5　展望

作为中药钩藤的主要有效成分之一，IRN在中枢神经系统相关疾病的治疗方面具有某些独特优势，对AD、PD、脑缺血再灌注损伤、抑郁症等疾病均有一定影响。但IRN药理作用的分子机制有待进一步探究，目前相关IRN剂型、药代动力学、毒副作用方面的研究也较少。且IRN的药理作用报道仅局限于细胞及动物层面，还未见相关的临床报道。IRN具有较强的药理活性，研发新药有一定的价值，需要在现有的基础上进行临床应用实验。