低频超声联合微泡及脑源性神经营养因子预防治疗大鼠缺血性卒中

王 毅，王 凌，康绍军*，曾 桂

(1.重钢总医院神经外科，2.放射科，3.超声科，重庆 400081)

脑卒中是全球第二大死亡原因和成人致残的首要原因[1],其中缺血性脑卒中发病率最高，我国的发病率约为43.70%～78.90%[2]。目前,缺血性脑卒中的临床治疗，除于发病急性期6 h以内溶栓以及后期功能锻炼外，尚无更有效的治疗措施。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神经生长因子家族成员之一，具有保护神经元、减少神经元凋亡、促进神经元在有害环境下生存等作用[3-5]。BDNF治疗实验性卒中，可促进卒中后神经功能恢复，改善卒中预后[6]。正常血脑屏障(blood brain barrier， BBB)通透性低，外周大分子物质很难通过BBB进入中枢神经系统[7]。另外，外周血液系统内存在的BDNF内切酶，导致BDNF半衰期短，剂量不稳定，限制其临床应用[6]。研究[8]显示，卒中后静脉注射5 μg BDNF对大鼠梗死范围无保护作用，而对BDNF进行化学修饰后，可与BBB上转铁蛋白受体(transferrin receptor， TfR)结合，进入大脑发挥保护作用。近年研究[9]表明,超声联合微泡可以靶向开放BBB，使得大分子药物有机会直接通过BBB进入特定区域发挥治疗作用，从而简化或省去药物的化学修饰过程。笔者应用这一效应实现BBB早期开放，对大脑中动脉梗阻(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型预防性静脉注射BDNF，旨在评价其对急性缺血性脑卒中缺血部位的预防性治疗效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠27只，体质量约200～300 g(购自第三军医大学实验动物中心)，随机分为假手术组、BDNF组、BDNF超声组，每组动物9只。饲养室内温度(22±1)℃,12 h循环黑白照明，自由取食与饮水。所有动物饲养的设施和环境遵照国家标准《实验动物环境及设施》(GB14925-2001)，饲养管理和实验操作符合《北京市实验动物管理条例》的有关标准。本实验经我院实验动物伦理委员会批准。

1.2 MCAO模型的建立及治疗 术前12 h实验动物禁食不禁饮。经尾静脉缓慢推注2.5%戊巴比妥钠(Sigma-Aldrich公司)2.5 mg/kg体质量进行麻醉，将实验动物仰卧保定于解剖台，颈部备皮并消毒。于颈部正中切口，暴露颈前肌，沿右侧胸锁乳突肌间隙分离肌肉组织，分离暴露右侧颈总动脉(common carotid artery, CCA)、颈内动脉(internal carotid artery， ICA)和颈外动脉(external carotid artery， ECA)。结扎ECA近心端和远心端，中间剪断，暂时夹闭ICA、CCA。将尼龙线插入ECA，用5-0丝线用力结扎，打开ICA处动脉夹，将尼龙线插入ICA，继续插入颅内至微感阻力，插入深度约(18.5±0.5)mm，使尼龙线头端通过大脑中动脉起始处，到达较细的大脑前动脉，结扎ECA、固定尼龙线并防止出血。阻断1 h后退出尼龙线进行再灌注，5-0慕丝线结扎ECA，逐层缝合。术后连续3天注射青霉素钠(山东鲁抗医药股份有限公司),每天2.5万U/kg体质量。

假手术组：只进行术前麻醉和血管分离术，不结扎及导入线栓；BDNF组：在模型建立前通过尾静脉预防性注射50 μg BDNF(Sigma-Aldrich公司)，不进行超声辐照；BDNF超声组：经尾静脉注入50 μg BDNF和2 ml超声造影剂声诺维(干粉溶于5 ml生理盐水；SonoVue，Bracco公司)，以超声诊断仪(HP Sonos-5500型)S3探头辐照动物颅脑10 min。频率采用谐波1.7 MHz/3.3 MHz，成像深度3 cm，超声输出机械指数为1.0，超声重复频率1 Hz。实验结束后，将动物回笼饲养。术后24 h后每组取3只动物检测脑组织内BDNF浓度，剩余动物在术后第1、3、7天进行MR检查并进行行为学评价，最后取脑进行TTC染色。

1.3 ELISA检测 取各组动物梗死部位相同质量的脑组织，按照W/V=11∶100加入蛋白裂解液充分匀浆并提取蛋白，按照ELISA试剂盒说明书检测BDNF含量，并计算对应的浓度值。

1.4 MR检查 采用Agilent 7.0T MR仪(美国安捷伦科技有限公司)。术后第1天行DWI，参数：15层，层厚1 mm，层间距0，TR 2 000 ms, TE 36 ms，回波间隔时间10 ms, 平均次数20, FOV 30 mm× 30 mm，矩阵128×128。术后第3天和第7天采用FSEM T2W序列扫描，参数：15层，层厚1 mm，层间距0，TR 2 524 ms, TE 20 ms，回波间隔时间 20 ms,平均次数16，FOV 40 mm×40 mm，矩阵196×196。

1.5 TTC染色 经生理盐水灌注后取脑，保持大脑的完整性。-20℃冰箱中速冻20 min左右，用专用脑槽，将大脑切片，然后置于0.05%新鲜配置的TTC中，37℃避光孵育15～30 min，PBS洗3次，每次约1 min，多聚甲醛固定30 min～24 h。

1.6 行为学评价 术后第1天、第3天和第7天，采用改良的Bederson评分对大鼠进行行为学评价。0分，行为完全正常；1分，提起鼠尾离开地面，对侧前肢内旋、内收；2分，放至地面，手术对侧抗力下降者；3分，观察其行走，围绕手术对侧转圈者；4分，无法自主活动者。

1.7 统计学分析 采用SPSS 14.0统计分析软件。计量资料以±s表示，3组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。3组行为学评分的比较采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织内BDNF含量 术后24 h，3组间脑组织BDNF水平比较差异均有统计学意义(F=22.83，P均<0.05)，两两比较示BDNF组 [(79.8 ± 20.8)pg/ml]、BDNF超声组[(127.0 ± 22.9)pg/ml]脑组织BDNF水平均高于假手术组[(46.9 ± 17.9)pg/ml](P均<0.05)；BDNF超声组高于BDNF组(P<0.05)。

2.2 脑梗死面积 BDNF组：随着时间的延长，高信号梗死区域逐渐增大，术后第7天梗死区面积基本接近半个脑。BDNF超声组：随着时间的延长，高信号梗死区域面积逐渐缩小，术后第7天时，梗死区面积小于术后第1天和第3天。术后第7天BDNF超声组梗死区面积比BDNF组小，水肿较BDNF组轻(图1)。脑组织TTC染色示术后第7天BDNF超声组白色缺血梗死区面积明显较BDNF组小(图2)。

2.3 行为学评价 术后第1天、第3天，BDNF组和BDNF超声组行为学评分差异无统计学意义。术后第7天，BDNF超声组的行为学评分明显低于BDNF组(P<0.05)，见图3。

图1 大鼠脑部冠状位MRI显示梗死灶区域为高信号区 术后第1天、第3天、第7天假手术组(A～C)、BDNF组(D～F)和BDNF超声组(G～I) 图2 术后第7天脑组织TTC染色图 A.假手术组; B.BDNF组; C.BDNF超声组 (白色区域为梗死灶)

图3 术后第1天、第3天和第7天,假手术组、BDNF组和BDNF超声组大鼠Bederson评分随时间的变化曲线

3 讨论

我国脑血管病的患病率高，临床死亡率高，后遗症多。BDNF作为潜在的药物分子，被用来治疗包括缺血性卒中等多种神经系统疾病。抑制或因敲除BDNF可扩大卒中梗死体积，应用BDNF治疗实验性卒中，可促进卒中后神经功能恢复，改善卒中预后[3-5]。外周血液系统存在BDNF内切酶，导致外周给药半衰期短，剂量不稳定。因此，BDNF安全、稳定、高效地跨越BBB到达靶区，是BDNF治疗缺血性脑卒中的关键。

BBB是维持中枢神经系统内环境稳定的重要结构，很多治疗中枢神经系统疾病的药物由于BBB的作用而难以在脑组织达到有效浓度，不能充分发挥疗效[10]。目前跨越BBB给药的方式主要有4种：①穿颅路径或经鼻路径给药，但易损伤脑组织及并发感染等；②利用甘露醇等前体药物开放BBB[11]，促进药物进入脑组织，但此方式弥散性开放全脑的BBB，药物会对正常组织造成影响；③对药物进行脂溶性化学修饰、改变分子量大小和电荷以促进其跨BBB[12]，但给药效率较低；④利用高分子药物载体，如脂质体，但载体的载药量较低，难以达到治疗浓度。

研究[9]表明，超声微泡介导声孔效应可以靶向性、可逆性开放BBB，引起BBB通透性暂时增加，同时并未引发局部脑组织的明显损伤。已有研究[13-14]证实，低频诊断超声可穿透颅骨准确聚焦开放BBB，同时微泡的应用大大降低了超声的空化阈值。Fan等[15]将微泡同伊文思蓝染料共同经静脉注射到动物体内，结果发现超声照射区域内伊文思蓝染料的溢出率明显高于非照射区域，而单独超声照射的对照组双侧无明显变化；实验中各组均无出血或其他脑实质损害。

本研究对MCAO动物模型预防性使用BDNF，并通过超声微泡介导的BBB靶向开放效应，提高BDNF的局部浓度，验证其对中枢神经系统疾病的预防性治疗作用。结果发现，在治疗后24 h，BDNF超声组脑组织中BDNF含量明显高于BDNF组及假手术组，提示超声促进了药物在治疗区的聚集。另外，本研究还发现BDNF组脑组织中BDNF含量高于假手术组，可能随着脑缺血的发展，BBB逐渐被破坏，血液循环中BDNF部分进入了梗死区域。BDNF超声组MRI上高信号梗死区面积随时间逐渐缩小，第7天时，其梗死区域小于第1天和第3天。与BDNF组比较，BDNF超声组梗死区域也明显缩小，且水肿较轻。尽管BDNF可以随着BBB破坏而进入梗死区，但随着药物在血液中的降解，进入梗死区的BDNF尚不能达到有效的治疗剂量，故BDNF组的梗死面积与BDNF超声组比较具有较大的差异。TTC染色结果与MRI结果一致。行为学结果显示，术后第7天BDNF超声组的评分明显低于BDNF组。均提示BDNF对神经系统具有明显的保护和治疗作用，并且超声微泡介导的声孔效应开放了目标区域的BBB，提高了药物在靶区的治疗浓度，促进了神经功能的恢复。

综上所述，本研究观察BDNF在超声介导下对MCAO大鼠模型的治疗作用，为缺血性脑损伤等中枢神经系统疾病的治疗提供了一种高效、无创、安全的治疗方法。

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