毛细管电泳－电化学发光法测定金钗石斛中石斛碱的含量

邓光辉，罗珍连

（广西民族大学 化学化工学院 广西林产化学与工程重点实验室，南宁530006）

金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl）为兰科属多年附生草本植物，其入药始载于《神农本草经》，享有“仙草”之美誉，是名贵中药材石斛的来源之一［1］。金钗石斛的主要有效成分有生物碱类化合物、酚类化合物、多糖等［2］，其中，生物碱类成分是最早从石斛属植物中分离得到的物质［3］。石斛碱为金钗石斛的特征性成分，具有止痛、解热、降低心率和血压、减慢呼吸、解巴比妥毒等作用［4－5］，有较高的研究开发价值。2010年版《中国药典》以石斛碱含量作为金钗石斛的质量控制指标［6］。

石斛碱的测定方法有气相色谱法［7－8］和高效液相色谱法［9－10］。与高效液相色谱法相比，毛细管电泳－电化学发光法（CE－ECL）是一种高效快速、样品消耗少、成本低的分离检测技术［11－12］。CE－ECL已经成功应用于生物碱研究［13－17］，但尚未见到 CEECL测定金钗石斛碱的报道。本工作对金钗石斛中具有药理活性成分的石斛碱进行提取，采用CEECL测定其含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

MPI－A型毛细管电泳电化学发光检测系统，配未涂层石英毛细管（50μm×55cm）、直径500μm铂工作电极、Ag／AgCl参比电极和铂辅助电极；PHS－3E型酸度计；KQ－100DB型数控超声波清洗器；1810－B型自动双蒸馏器。

Ru（bpy）32＋溶液：5mmol·L－1，称取适量三联吡啶氯化钌六水合物，用水溶解配制成20mmol·L－1溶液，再用70mmol·L－1磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 8.10）稀释配制成5mmol·L－1。

标准储备溶液：500mg·L－1，称取石斛碱对照品5.0mg置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，使用时用pH 8.10PBS进行稀释。

石斛碱标准品纯度99%，三联吡啶氯化钌六水合物、甲醇、乙醇为分析纯，试验用水为二次蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

称取金钗石斛粉末1.000 0g置于100mL锥形瓶中，加入乙醇50mL，称定质量，超声提取30min，冷却，再称定质量，用无水乙醇补足失重，滤液经0.45μm乙酸纤维膜过滤备用。

依次 用 0.1mol·L－1NaOH 溶 液、水、10mmol·L－1PBS（pH 5.13）运行缓冲溶液将石英毛细管冲洗10min，将工作电极依次用0.3，0.05μm Al2O3粉末抛光，用水冲洗，再用水超声清洗干净，吹干，将电极与毛细管安装在检测池上，用光学显微镜调节毛细管与工作电极之间的距离为（100±5）μm。

在检测池中加入5mmol·L－1Ru（bpy溶液，测定时将毛细管进样端插入10mmol·L－1PBS（pH 5.13）中，待发光信号稳定后，采用电动进样，进样电压为10kV，进样时间为10s，光电倍增管高压为800V，检测电位为1.17V，施加分离电压为15kV进行分离检测。

所有溶液在进入毛细管前经0.45μm乙酸纤维素膜过滤，每2h换一次检测池溶液，以保证试验的稳定性。

2 结果与讨论

2.1 石斛碱与三联吡啶钌发光体系的电化学发光行为

在检测池中先加入5mmol·L－1Ru（bpy溶液进行循环伏安扫描，记录电极电流和电化学发光曲线。加入3.4mg·L－1石斛碱溶液后，再进行循环伏安扫描，记录电极电流和电化学发光曲线，结果见图1。

图1 循环伏安图（a）和电化学发光曲线（b）Fig.1 Cyclic voltammograms（a）and the profile of electrochemiluminescence（b）

由图1可知：三联吡啶钌只有较小的电极电流和弱的电化学发光信号；当加入石斛碱后，电极电流和电化学发光信号都得到明显的增强。基于石斛碱对三联吡啶钌的电化学发光的增强作用，可建立毛细管电泳－电化学发光法测定石斛碱的含量。

2.2 检测条件的选择

2.2.1 检测电位

采用恒电位法在1.0～1.35V（vs.Ag／AgCl）内考察检测电位对电化学发光（ECL）强度的影响，结果见图2。

由图2可知：当检测电位升至1.17V时，石斛碱的ECL强度最大。因此，试验选择1.17V作为检测电位。

图3 Ru（bpy浓度对电化学发光强度的影响Fig.3 Effeet of concentration of Ru（bpy on ECL intensity

2.2.3 运行缓冲溶液的浓度和酸度

试验考察了5～30mmol·L－1内的运行缓冲溶液对ECL强度的影响，结果见图4。

由图4可知：随着运行缓冲溶液浓度的增大，ECL强度逐渐增大；当其浓度为10mmol·L－1时，ECL强度达到最大；浓度高于10mmol·L－1时，ECL强度逐渐减小。因此，试验选择10mmol·L－1磷酸盐缓冲溶液为运行缓冲溶液。

缓冲溶液的酸度也会影响毛细管电泳的分离效果和ECL强度，影响分析物的电离度，还会影响电渗流（EOF）的大小。试验考察运行缓冲溶液在pH 3.50～8.50内对ECL强度的影响，结果见图5。

图4 运行缓冲溶液浓度对电化学发光强度的影响Fig.4 Effect of concentration of the running buffer solution on ECL intensity

图5 运行缓冲溶液酸度对电化学发光强度的影响Fig.5 Effect of acidity of the running buffer solution on ECL intensity

由图5可知：当运行缓冲溶液pH为5.13时，ECL强度最大。因此，试验选择pH 5.13的10mmol·L－1磷酸盐缓冲溶液为运行缓冲溶液。

2.2.4 检测池中缓冲溶液的浓度和酸度

固定检测池中磷酸盐缓冲溶液浓度为60mmol·L－1，考察其 pH 在6.00～9.50内对ECL强度的影响，结果见图6。

由图6可知：pH 为6.00～8.10时，ECL强度随检测池中磷酸盐缓冲溶液pH增大而增大；pH为8.10～9.50时，ECL强度随pH 增大而减小。因此，试验选择pH 8.10的磷酸盐缓冲溶液。

选用pH 8.10磷酸盐缓冲溶液，考察其浓度在50～90mmol·L－1内对ECL强度的影响，结果见图7。

由图7可知：当检测池中磷酸盐缓冲溶液浓度为70mmol·L－1时，ECL强度达到最大。因此，试验选择检测池中磷酸盐缓冲溶液的浓度为70mmol·L－1。

图2 检测电位对电化学发光强度的影响Fig.2 Effect of detection potential on ECL intensity

2.2.5 分离电压和进样时间

试验考察了分离电压在10～18kV内对ECL强度的影响。结果表明：当电压在10～15kV内逐渐升高时，ECL强度逐渐增大；当分离电压高于15kV时，基线噪声大。因此，试验选择分离电压为15kV。

采用电动进样，选择进样电压为10kV，考察了进样时间在5～15s内对ECL强度的影响。结果表明：随着进样时间的增加，ECL强度逐渐增大；当进样时间超过10s时，ECL强度增长缓慢且偏离线性、有拖尾现象。因此，试验选择进样时间为10s。

图6 检测池中磷酸盐缓冲溶液酸度对电化学发光强度的影响Fig.6 Effeet of acidity of PBS in detection cell on ECL intensity

图7 检测池中磷酸盐缓冲溶液浓度对电化学发光强度的影响Fig.7 Effeet of concentration of PBS in detection cell on ECL intensity

2.3 标准曲线和检出限

在试验条件下，石斛碱质量浓度在1.0～100mg·L－1内与其峰面积呈线性关系，线性回归方程为y＝374.9 x－85.81（y为ECL信号的峰面积，x为石斛碱的质量浓度），相关系数为0.999 7。

以3倍信噪比计算方法的检出限（3S／N）为0.045mg·L－1。

2.4 样品分析与加标回收试验

按试验方法测定金钗石斛样品中的石斛碱，对照品及样品的电泳图见图8。

图8 毛细管电泳图Fig.8 Capillary electrophoresis charts

图8 曲线3为金钗石斛样品的电泳图，图中只有一个峰，与对照品的出峰时间一致，且加入石斛碱标准溶液后峰信号增强，见图8曲线2，与石斛碱对照品电泳图（图8曲线1）进行比较可知，样品谱峰为石斛碱。经计算，该批金钗石斛中石斛碱质量分数为0.32%。

取已知含量的样品提取液，按试验方法进行加标回收试验，测定值与回收率结果见表1。

表1 样品分析结果和回收试验结果（n＝5）Tab.1 Results of tests for sample analysis and recovery（n＝5）

本工作采用毛细管电泳－电化学发光法测定金钗石斛中石斛碱的含量，方法简单、快速，与药典规定的测定方法相比，本方法具有进样量少、分析速率快、灵敏度高、设备低廉、装置及操作简单等优点。

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