转基因及基因编辑技术与猪遗传育种

李嘉楠，顾 浩，徐在言，左 波

（华中农业大学动科动医学院，农业农村部猪遗传育种重点实验室，农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，湖北 武汉 430070）

1 转基因与基因编辑技术概述

转基因动物技术是指使用显微注射或精子介导等相关分子生物学方法将外源基因导入到动物的早期胚胎细胞中，使外源基因能够在受体细胞的基因组中稳定表达，并培育出可遗传的动物个体或品系。与传统的育种技术相比，转基因技术不仅克服了物种间固有的生殖隔离，而且实现了物种间遗传物质的交换。然而在动物育种中，许多优良性状的产生并不需要依赖外源基因的导入，仅仅改变自身基因的表达就能获得，这种方式被称为基因编辑技术。新型动物基因编辑技术是指通过人工核酸酶对动物特定的内源性基因进行目地性的修饰，如敲除、敲入、定点突变等，并结合体细胞核移植与胚胎移植等技术手段，获得被修饰编码的个体。在基因编辑中，人工核酸酶作为操作基因的“剪刀”，可精确定位到需要编辑的DNA双链，造成目的基因DNA双链断裂（DNA double-strand-breaks，DSBs）；同时，DNA的（非）同源重组修复可作为“缝针”对断裂的DNA双链进行修复，实现基因的敲除和敲入。而随着人工核酸酶技术的不断发展，基因编辑技术共经历了三代，即锌指核酸 内 切 酶（zinc finger endonucleases，ZFNs）、类转录激活因子效应物核酸 内 切 酶（transcription activatorlike effector endonucleases，TALENs）和 CRISPR/Cas9 [clustered regulatory interspaced short palindromic repeats /Cas（CRISPR associated 9）]技术。

锌指核酸内切酶是第一代人工核酸内切酶，它是由锌指蛋白和核酸酶FokⅠ组成可以结合DNA的嵌合蛋白。研究者按照1个锌指可以识别3个碱基的识别规律来设计相应的锌指蛋白，对DNA序列进行特异性识别。自2002年，首次在果蝇中应用成功后，Whyte等用ZFNs技术和体细胞核移植技术结合生产出eGFP转基因猪，证明了ZFNs技术可以对体细胞核移植的供体细胞进行修饰。第二代人工核酸内切酶——类转录激活因子效应物核酸酶TALENs，其蛋白结构大小和锌指蛋白一样，除了TALENs的DNA结构域仅识别一种碱基之外，其他的作用机制与ZFNs完全一致，这就大大加快了组装识别任何靶基因的TALENs。

CRISPR/Cas9系统作为第三代基因编辑工具，是由Ishino等于1987年在K12大肠杆菌中发现，是广泛存在于细菌和古细菌体内的一种获得性免疫系统[6]。改造后的Cas9系统主要由向导RNA和Cas9蛋白组成，向导RNA由一段20 bp大小的识别序列和一段可形成发卡结构的重复序列组成。识别序列通过碱基互补，靶向到基因组相应的位置，重复序列与Cas蛋白形成复合体并发挥酶切作用，切断目标区域的双核苷酸链。2013年，Feng Zhang等首次利用这一原理应用到真核细胞中，正式将其开发为基因组编辑新技术[7]。与前两代人工核酸酶系统相比，CRISPR/Cas9系统简洁高效，称得上是21世纪重要的生物技术突破，为基因编辑技术提供了一个新的平台。自从2013年第1头使用CRISPR/Cas9基因敲除猪诞生后，目前利用CRISPR/Cas9技术进行功能基因筛选、抗病育种等研究在猪遗传育种的应用上均已实现。

2 基因编辑技术在猪遗传育种中的应用

2.1 提高猪只抗病能力

猪繁殖与呼吸综合征（也称猪蓝耳病，PRRS）是一种由PRRS病毒引起的繁殖障碍和呼吸系统的传染病，可导致母猪妊娠后期流产，仔猪呼吸系统疾病和大量死亡。同时由于猪蓝耳病病毒的极高突变率和致病性，用疫苗难以进行防治，严重影响着养猪业。研究表明清道夫受体CD163是猪蓝耳病病毒入侵细胞时的重要识别蛋白。2017年，Chrisine Burkard等 的研究团队使用CRISPR/Cas9技术敲除猪CD163基因之后，进行侵毒试验，结果表明转基因敲除猪对PRRSV具有显著抗病性。猪圆环病毒病是由圆环病 毒 2 型（porcine circovirus type 2，PCV2）引起的多种疾病，可导致母猪繁殖障碍和断乳仔猪多系统衰竭综合征等，严重影响着我国养猪业的发展。研究发现该病毒是通过上调猪体内p53基因的表达来实现感染宿主细胞，导致宿主细胞的死亡。Xu等利用CRISPR/Cas9技术建立了P53基因敲除的PK15细胞系，来研究PCV2感染后p53基因所发挥的调控作用，为获得抗猪圆环病毒病奠定了基础。目前，利用基因编辑技术获得的抗猪瘟病毒转基因猪和抗小猪腹泻转人溶菌酶基因猪等抗病猪的产生，为我们防治猪病提供了另一条途径。通过改变以往的药物防治，从遗传本质上提高猪对疾病病原的免疫力，减少抗生素的使用，做到防重于治、养重于防，对养猪业的发展以及人类健康都具有深远意义。

2.2 提高生产性能

我国作为养猪大国，养猪不仅能够为农业经济带来迅猛发展，而且猪肉作为人类生活肉类食品的重要来源，优质猪新品种的培育成为研究者的重中之重。1985年，Hammer 等的研究团队将人的生长激素注射进猪的受精卵中，获得的转基因猪与非转基因猪相比，生长速率、饲料转化率都有明显提高。随后中国农业大学与湖北省农业科学院生物技术研究所合作，将猪的生长激素基因（growth hormone，GH） 转 入 湖北白猪获得的转基因猪，其生物转化率比同窝提高10%左右。肌肉生长抑制素myostatin（MSTN）是继生长激素（GH）和胰岛素样生长因子（IGF）的又一新功能基因，对肌肉生长起负调控作用，控制猪个体生长发育和脂肪沉积，是改善猪生长性能的有效基因。2016年Bi等用CRISPR/Cas9技术得到了MSTN基因单敲除猪，使肌源性基因表达量上升，肌纤维数目的显著增加表现出特定的“双肌臀”现象。MSTN主动免疫还可以抑制肌酸激酶的活性，控制蛋白表达，提高个体瘦肉率。还有研究进一步发现 MSTN 对脂肪发育的抑制作用可下调PPARγ抑制脂肪形成。由MSTN诱导的脂肪细胞有提高胰岛素和葡萄糖的敏感性及氧化能力等特点。因此，MSTN在畜牧生产过程中具有很好的研究意义和经济价值。

2.3 改善猪肉质量

不饱和脂肪酸是人体所需的必需脂肪酸，对人体有很大的好处，可以改善心血管、降低老年痴呆和抑郁症等。而猪肉中却含有大量的饱和脂肪酸，食用大量的猪肉会使人产生高血压、高胆固醇等疾病，增加冠心病的风险。2004年，K．Saeki等人将菠菜根部的FDZA基因转入猪的基因组中，获得了高不饱和脂肪酸转基因猪。2006年，Lai等研究证明秀丽线虫的FAT-1基因可以使猪肉中ω-6脂肪酸转变为ω-3脂肪酸，通过体细胞克隆技术把该基因导入猪的基因组，培育出了富含ω-3脂肪酸的转基因猪。随后，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所和军事医学科学院生物工程研究所合作也获得了转ω-3脂肪酸去饱和酶基因的转基因猪，大大提高了猪肉的营养价值。过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子α（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha， PGC1α），可诱导线粒体的生物合成和细胞呼吸功能，调控肌纤维类型转化，改善猪肉品质性状，2017年，华中农业大学通过转基因猪模型超表达PGC1α基因，证实了肌纤维类型的转变，由酵解型肌纤维转化为氧化型肌纤维，为后续的肉质改良工作打下基础。

2.4 降低环境污染

近年来，伴随着农业经济的发展，养殖业规模化、集约化程度的不断提高，养殖场排出的粪便也日益增加，其环境污染问题也日益突出。由于养殖户环保意识不强、粪便处理能力差，导致养殖场的排泄物是继工业三废后的又一大污染源。植酸即肌醇六磷酸，作为磷酸的储存库，通常存在于植物中。饲料中富含的植酸未能被猪完全利用，不仅降低了氮磷利用率，也是粪便中氮、磷排放的主要来源。植酸酶（phytase）能有效分解植酸，催化肌醇六磷酸脱掉磷酸基团，早在19世纪初就引起了人们的注意。2001年，加拿大研究人员通过将大肠杆菌的phytase基因转移到猪上，培育出可在唾液中分泌植酸酶的转基因猪，不仅提高了猪对饲料中磷的利用率，也使猪粪中的磷含量出现显著下降，且相对照于在饲料中添加植酸酶的猪其磷排放量也出现明显降低。随后，转葡聚糖酶、转木聚糖酶及转真菌纤维素酶等转基因猪的相继出现，使得猪对于饲料中蛋白、纤维素、有机磷等营养物质的利用率显著提高，进而显著减少磷、氮排放。最近，华南农业大学吴珍芳团队利用转基因技术和体细胞克隆技术将4种微生物的酶类基因转入猪的基因组中，获得了无污染、高品质、快生长转基因克隆猪。这4种酶类微生物只在猪的唾液腺中特异性分泌，伴随饲料进入消化道，持续降解饲料中的有机磷，显著提高了氮、磷、钙等营养物质的吸收，同时与普通猪相比，粪便中氮、磷的排放下降了20%。

2.5 异体器官移植

人的器官移植供体资源短缺，最好的解决办法就是异体器官移植。目前，猪在器官大小、生理、组织解剖上与人类相似，被认为是最佳异体器官移植的首选动物。异体器官移植的障碍往往在于细胞间的免疫排斥和猪内源性逆转录病毒。1995年，Cozzi等将人的补体抑制因子和衰退加速因子共转到猪的胚胎中，获得的转基因猪在器官移植中未出现超敏排斥反应。2001年，研究人员通过对猪器官的细胞免疫抗原因子α-1，3半乳糖酶进行敲除，将获得的转基因猪器官移植给非人灵长类动物，数月后同样未出现免疫排斥现象。2005年，Miyagawa等使用RNAi技术来抑制猪内源逆转录病毒的表达，结果显示，RNAi可以抑制猪逆转录病毒在内皮细胞的表达，为生产抗猪逆转录病毒的转基因猪提供了一个新方法。2015年，美国印第安纳医学院等培育了唾液酸糖蛋白受体基因敲除猪，减少在器官移植过程中血小板减少症的发生。人血栓调节蛋白（hTM）可以在血管内皮细胞特异性表达，具有抗凝作用，清除体内凝血酶，目前，已经有研究团队成功获得可特异性表达hTM转基因细胞系及转基因克隆猪，为解决异体器官移植后凝血紊乱提供理论资料。

2.6 动物疾病模型

合适的动物模型可以推动医疗技术的发展，和啮齿类的大、小鼠等相比，猪、羊等大动物与人类在基因组上有较高的同源性，且在体型、生理代谢、疾病特征上的优势更适合用作动物模型、人类疾病和生物制药等研究。2010年，Yang等使用亨廷顿蛋白转基因载体，成功获得6头亨廷顿舞蹈症转基因猪，该成果对于亨廷顿舞蹈症病理发生机制的研究奠定了基础。Lp-PLA2基因可调节动脉粥样硬化，2013年，纪元等获得了Lp-PLA2基因的猪成纤维细胞系，为开发治疗动脉粥样硬化药物提供新的模型和突破。2015年，北京蛋白质组研究中心使用CRISPR/Cas9技术在猪白蛋白基因区域插入了人类白蛋白基因，让猪只产生人血白蛋白，而不产生猪白蛋白。2016年，中国科学院使用单碱基基因编辑技术，仅仅只改变一个碱基，便获得了只分泌人胰岛素的克隆猪，提取的胰岛素完全为人胰岛素，而不含猪胰岛素。因此，使用新型基因编辑技术寻找疾病早期分子标志、阐明相关疾病发病机理、研究新的治疗方法、和开发新药具有重要意义。

3 展望

随着基因编辑技术的不断发展，不断成熟，基因编辑和转基因动物的生产及相关产品已显示出了广阔的应用前景和重大的经济价值。基因编辑的工具越来越精细化，不仅可对基因进行大片段的删除或转入，也能实现定点单个碱基的改变，基因定点编辑技术已逐步成为转基因技术研究的核心。尽管对基因的可操纵性越来越强，但是要形成稳定安全的新品种（系），并进入产业化、市场化，还需要与传统育种技术结合，并开展转基因动物的安全评价以及消费者的认可，目前已有多个转基因猪新材料正在进行农业部安全评价，如MSTN基因敲除猪、转ω-3脂肪酸去饱和酶基因猪等，相信这些育种新材料将会给我国养猪业带来新的发展机遇。

（参考文献略）