不同甲酯化方法对开口箭地上部位脂肪酸分析的影响

柏国清，路强强，陈智坤，赵 宁，张忠飞，石新卫*

(1.陕西省西安植物园，陕西 西安 710061；2.陕西省植物资源保护与利用工程技术研究中心，陕西 西安 710061；3.上海交通大学 农业与生物学院，上海 200240)

开口箭(Campylandrachinensis)又名竹根七，系百合科(Liliaceae)开口箭属多年生草本植物，主要分布于我国中部及西南部[1]，陕西太白山及秦岭以南大部分地区均有分布[2]。其根茎味甘微苦，性寒，多为民间用药，具有清热解毒、祛风除湿、散瘀镇痛等功效[3]。化学成分研究表明，开口箭根茎中主要含有甾体皂苷、黄酮和强心苷类化合物，挥发油成分主要为烃类、含烃衍生物和甾族等，其脂肪酸主要为正十六烷酸、正十八烷酸、亚油酸、反-油酸等[4-6]，而开口箭地上部位化学成分的研究并未见文献报道。脂肪酸是植物体主要的化学成分之一，由于其长碳链、高沸点、难挥发等特性，导致脂肪酸的分离与检测困难，故对其组分进行分析时，需对样品进行甲酯化衍生处理[7-8]。本试验采用BF3-CH3OH甲酯化法和HCl-CH3OH甲酯化法对开口箭地上部位脂肪酸进行预处理，利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)测定和NIST2011谱库检索，旨在比较和评价不同甲酯化方法对开口箭地上部位脂肪酸分析的影响。

1 材料与方法

1.1 药材

开口箭地上部位于2016年9月采自陕西秦岭南坡的牛背梁地区，海拔1 100 m，经陕西省植物研究所周亚福副研究员鉴定。

1.2 仪器与试剂

微型中草药粉碎机FW177，天津市泰斯特仪器有限公司；电子分析天平FB124，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；索氏提取器ZH114555C，北京欣维尔玻璃仪器有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器DF-101S，郑州科丰仪器设备有限公司；旋转蒸发仪OSB-2100，日本EYELA(东京理化)器械株式会社；气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)7890A-5975C、自动进样器7683，美国安捷伦公司。

BF3-CH3OH(50%，m·V-1)分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水硫酸钠、氢氧化钾、浓盐酸、无水乙醚、甲醇、正己烷均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；水为纯净水。

1.3 方法

1.3.1 开口箭地上部位脂溶性成分提取 开口箭地上部位样品作阴干处理，粉碎过60目筛，精密称取2份，每份60.00 g，分别置于索氏提取器中，以无水乙醚为溶剂，45℃回流提取3 h，45℃减压蒸馏，回收乙醚[9]，分别得清亮透明淡黄绿色脂肪油，40℃水浴，挥干溶剂。

1.3.2 BF3-CH3OH甲酯化法 取1 mL正己烷完全溶解上述1份脂肪油，加入到含有5 mL 0.5 mol·L-1KOH-CH3OH溶液的25 mL圆底烧瓶中，摇匀后于75℃油浴，回流皂化1 h，冷却后加入正己烷重复洗涤[10]；然后用2 mol·L-1HCl调节pH为3.0，最后置于25 mL分液漏斗，用等体积正己烷萃取，40℃减压蒸馏，回收正己烷，浓缩至约1 mL；加入2 mL BF3-CH3OH(14%，m·V-1)溶液,于80℃油浴,甲酯化30 min，随后加入2 mL水终止反应，并置于25 mL分液漏斗，用正己烷萃取3次，取上层溶液，无水硫酸钠干燥处理即得脂肪酸甲酯化物；待溶剂于40℃减压蒸馏回收后，另取0.5 mL正己烷重新溶解，并过0.45 μm微孔滤膜，备GC-MS分析测试用[11]。

1.3.3 HCl-CH3OH甲酯化法 取1 mL正己烷完全溶解上述1份脂肪油，加入到含有5 mL 饱和KOH-CH3OH溶液的25 mL圆底烧瓶中，摇匀后于75℃油浴，回流皂化30 min[12]；冷却后加入5 mL 2 mol·L-1HCl-CH3OH溶液，于80℃油浴，甲酯化10 min；冷却后，置于25 mL分液漏斗，用正己烷萃取3次，取上层溶液，无水硫酸钠干燥处理即得脂肪酸甲酯化物；待溶剂于40℃减压蒸馏回收后，另取0.5 mL正己烷重新溶解，并过0.45 μm微孔滤膜，备GC-MS分析测试用[13]。

1.3.4 GC-MS分析测试条件 色谱条件：DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为高纯度氦气(99.999%)，流速：恒流1.0 mL·min-1；程序升温：柱温70℃保持5 min，以70℃·min-1升至200℃，以2℃·min-1升至280℃；进样量为1.0 μL，分流比5∶1；进样温度270℃。质谱条件：电离方式为电子轰击离子源模式(EI+)，电离能量70 eV；离子源温度230℃，接口温度280℃，四级杆温度150℃；扫描方式为SCAN全扫描，质量扫描范围为33～500，溶剂延迟3 min；标准谱库为NIST2011版谱库[14]。

2 结果与分析

2.1 化学成分

按上述试验方法和条件，对开口箭地上部位的脂溶性成分进行提取和甲酯化处理，经GC-MS联用仪分析，并得到GC-MS总离子流色谱图(TIC)(图1)。通过NIST2011标准谱库检索和85%以上相似度筛选，共确认了31种化学成分，其中包括21种脂肪酸成分。利用峰面积归一化法并通过7890A-5975C化学工作站数据处理系统，求得各化学成分的峰面积相对含量(表1)。

2.2 脂肪酸种类与含量差异

表1分析发现，经BF3-CH3OH甲酯化法处理鉴定得到18种脂肪酸成分，主要种类有(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸(24.483%)、正十六烷酸(16.693%)、(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸(14.830%)、正十九烷酸(8.229%)、正十二烷酸(3.257%)等；经HCl-CH3OH甲酯化法处理鉴定得到14种脂肪酸成分，主要种类有正十九烷酸(24.824%)、(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸(16.013%)、正十六烷酸(10.987%)、(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸(9.263%)、正十七烷酸(1.722%)等。

表1 开口箭地上部位脂溶性成分甲酯化处理情况及相对含量

图1 BF3-CH3OH和HCl-CH3OH甲酯化法处理所得GC-MS总离子流色谱

2.3 2种甲酯化方法对脂肪酸鉴定的影响

经BF3-CH3OH和HCl-CH3OH 2种甲酯化方法处理，共鉴定得到21种脂肪酸成分，其中共有成分13种，前种处理方法鉴定的正十二烷酸、正十六烷酸、(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸、(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸含量明显高于后种处理方法鉴定所得，而癸二酸、正十四烷酸、十六烷酸硅、正十七烷酸、正十九烷酸含量明显低于后者。非共有成分中，前种处理方法鉴定得到阿魏酸、正十三烷酸、油酸、7,10-二烯基十六烷酸、(Z)-9-十六烯酸、L-抗坏血酸-2,6-二十六烷酸，而后种处理方法鉴定得到肉豆蔻油酸、三甲基硅烷基肉豆蔻酸。

3 结论与讨论

脂肪酸甲酯化是将高沸点且难挥发、气化的脂肪酸甘油酯和游离脂肪酸先皂化为脂肪酸，再使脂肪酸与甲醇充分反应，生成相应的脂肪酸甲酯，使其变成低沸点、易挥发、气化的物质。KOH-CH3OH溶液的回流皂化是经典的皂化方法[15]，0.5 mol·L-1和饱和KOH-CH3OH溶液是2种常用的皂化反应浓度，本试验中BF3-CH3OH甲酯化法取5 mL 0.5 mol·L-1KOH-CH3OH溶液回流皂化1 h和HCl-CH3OH甲酯化法取5 mL饱和KOH-CH3OH溶液回流皂化30 min均可实现1 mL脂肪油样品的充分皂化反应，并不会对进一步的甲酯化反应产生影响。

脂肪酸的甲酯化方法通常包括三氟化硼法、酸处理法和碱处理法。14%的BF3-CH3OH溶液60～100℃回流2～30 min是结合态、游离态脂肪酸常用的甲酯化方法[16]。酸处理法一般采用1%～20%的硫酸-甲醇溶液，60～90℃回流，反应时间不等，其甲酯化的主要是一般游离型和甘油三脂型的脂肪酸，然而反应体系中存在硫酸使甲醇脱水生成甲醚的副反应，有可能导致甲酯化反应的不完全[17]。因此，本试验选用了2 mol·L-1的HCl-CH3OH溶液，于80℃油浴回流10 min。

本研究利用索氏提取器提取开口箭地上部位中脂肪油，采用BF3-CH3OH和HCl-CH3OH 2种甲酯化法将其衍生为低沸点、易挥发、易检测的脂肪酸甲酯，经GC-MS分析和NIST2011谱库检索，共分离鉴定得到化学成分31种，其中脂肪酸成分21种，共有成分13种，正十三烷酸、肉豆蔻油酸、三甲基硅烷基肉豆蔻酸、(Z,Z)-7,10-十六碳二烯酸、(Z)-9-十六碳烯酸、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸、L-抗坏血酸-2,6-二十六烷酸、(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸和16-甲基十七碳酸均为首次从开口箭中分离鉴定得到。BF3-CH3OH甲酯化法分离鉴定的化学成分种类多，脂肪酸成分类型丰富，不饱和脂肪酸含量高，这与其反应机理密切相关：2 mol·L-1的HCl酸化调节可使反应溶液始终处于酸性条件，有利于脂肪酸酯的皂化，另外BF3作为酸性催化剂，能够消耗反应体系中存在的水并形成硼酸，有利于促进甲酯化反应的正向进行，且不会破坏不饱和脂肪酸。HCl-CH3OH甲酯化法虽处理过程简便，操作时间短，试剂用量少，但未开展方法学中HCl浓度、取用量、酯化温度和回流时间的考察，从而有可能造成甲酯化不彻底，导致分离鉴定的脂肪酸类型偏少、含量偏低。

(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸(亚油酸)是功能性多不饱和脂肪酸代表物质之一，研究表明其具有降低血清胆固醇和血脂的作用，有助于抑制动脉血栓的形成，可作为治疗动脉粥样硬化和心肌梗死等心血管疾病药物的原料[18]；(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸甲酯可作为表面活性剂原料，供洗涤剂、香料和化妆品用。(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸(亚麻酸)又称维生素F，是构成细胞膜和生物酶的基础物质，也是人体内必需的不饱和脂肪酸，临床研究表明其具有明显的抗脂质过氧化、降低胆固醇、降血脂、维持脂蛋白平衡、抑制血小板聚集和增加胰岛素分泌等作用[19]。

综上所述，经BF3-CH3OH甲酯化法处理开口箭地上部位脂溶性成分，有利于进一步开发利用其含有的不饱和脂肪酸。

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志:第15卷 [M].北京：科学出版社,1978:12-13.

[2] 中国科学院西北植物研究所编著.秦岭植物志:第3卷第1册[M].北京：科学出版社,1981:335.

[3] 肖艳华.开口箭化学成分及其抗禽流感H5N1活性研究[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院,2015.

[4] LIU C H,GUO Z Y,XUE Y H,etal.Five new furostanol saponins from the rhizomes ofTupistrachinensis[J].Fitoterapia,2012,83:323-328.

[5] 宁德生,蒋丽华,刘金磊,等.开口箭根茎中甾体化合物的研究[J].天然产物研究与开发,2014(6):879-882,901.

NING D S,JIANG L H,LIU J L,etal.Studies on steroids from the rhizomes ofTupistrachinensis[J].Nat.Prod.Res.Dev.,2014(6):879-882,901.(in Chinese)

[6] 王慧娜,赵桦.开口箭脂肪酸成分气相色谱-质谱分析[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(8):85-88.

WANG H N,ZHAO H.Analysis fatty acid compositions ofTupistrachinensisby GC-MS[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2011,17(8):85-88.(in Chinese)

[7] 梁海东,乔有明,裴海昆,等.不同前处理分析植物脂肪酸的气相色谱-质谱法研究[J].分析科学学报,2015,31(4):525-528.

LIANG H D,QIAO Y M,PEI H K,etal.Comparison of different pre-processing methods to identify fatty acids in plants by gas chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Analytical Science,2015,31(4):525-528.(in Chinese)

[8] 赵德义,张博勇,徐爱遐,等.脂肪酸在植物界中分布的研究[J].西北林学院学报,2005,20(3):147-149.

ZHAO D Y,ZHANG B Y,XU A X,etal.On distribution of fatty acid in plants area[J].Journal of Northwest Forestry University,2005,20(3):147-149.(in Chinese)

[9] 杨春艳,邹坤,潘家荣.开口箭挥发油成分的分析[J].三峡大学学报:自然科学版,2006,28(4):360-362.

YANG C Y,ZOU K,PAN J R.Study on volatile constituents fromTupistrachinensisBak[J].Journal of China Three Gorges University:Natural Sciences,2006,28(4):360-362.(in Chinese)

[10] 孟橘,夏天文,陈勇,等.GB/T 17376-2008 动植物油脂 脂肪酸甲酯制备[S].北京:中国标准出版社,2008:1-22.

[11] 范亚苇,邓泽元,余永红,等.不同脂肪酸甲酯化方法对共轭亚油酸分析的影响[J].中国油脂,2007,32(1):52-55.

FAN Y W,DENG Z Y,YU Y H,etal.Effect of fatty acid methyl esterification methods on analysis of conjugated linoleic acids[J].China Oils and Fats,2007,32(1):52-55.(in Chinese)

[12] 魏丽芳.反式脂肪酸检测方法的建立及应用[D].重庆：西南大学,2008.

[13] 张白曦,宋宇航,杨芹,等.甲酯化方法对甘油三酯和游离型脂肪酸混合物脂肪酸分析的影响[J].中国粮油学报,2016,31(9):95-99.

ZHANG B X,SONG Y H,YANG Q,etal.Comparison of methyl esterification methods in fatty acids determination of the mixture composed of triglycerides and free fatty acids[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2016,31(9):95-99.(in Chinese)

[14] 张静,周小婷,胡立盼,等.SPME-GC-MS测定不同品种牡丹花挥发性物质成分分析[J].西北林学院学报,2013,28(4):136-143.

ZHANG J,ZHOU X T,HU L P,etal.SPME-GC-MS measurement of volatile on different peony varieties[J].Journal of Northwest Forestry University,2013,28(4):136-143.(in Chinese)

[15] 刘帅,王爱武,李美艳,等.脂肪酸甲酯化方法的研究进展[J].中国药房,2014,25(37):3535-3537.

[16] 伍新龄,王凤玲,关文强.植物油脂肪酸甲酯化方法比较与含量测定[J].食品研究与开发,2015,36(7):84-87.

WU X L,WANG F L,GUAN W Q.Methods of methyl esterification and gas chromatography analysis of fatty acids in edible vegetable oil [J].Food Research and Development,2015,36(7):84-87.(in Chinese)

[17] 佘珠花.气相色谱法中油脂脂肪酸衍生化方法及其选择[J].粮食加工,2004(6):64-66.

SHE Z H.Oil fatty acid derivatization method and choose in gas chromatography[J].Grain Processing,2004(6):64-66.(in Chinese)

[18] 张春娥,张惠,刘楚怡,等.亚油酸的研究进展[J].粮油加工,2010(5):18-21.

[19] 董娟娥,马柏林,张康健,等.杜仲籽油中α-亚麻酸的含量及其生理功能[J].西北林学院学报,2002,17(2):73-75.

DONG J E,MA B L,ZHANG K J,etal.Contents and active function of α-linolenic inEucommiaulmoidesseed oil[J].Journal of Northwest Forestry University,2002,17(2):73-75.(in Chinese)