实体器官移植受者侵袭性真菌感染的实验室诊断

张坚磊（天津市第一中心医院检验科，天津 300192）

侵袭性真菌感染（invasive fungal infection，IFI）是指真菌侵入人体，在组织、器官或血液中生长、繁殖，并导致组织损伤及炎症反应的疾病。随着移植技术的成熟，实体器官移植（solid organ transplantation，SOT） 成功率显著提高。但SOT患者为免疫功能低下的典型群体，易受真菌感染，术后管理面临严峻挑战［1］。近年来，在SOT 受者中IFI的发生率呈逐年上升趋势，其病死率较高，已成为实体器官移植患者移植物功能丧失和死亡的重要原因之一。因此，如何正确认识不同器官移植患者发生IFI的危险因素，早期诊断并及时进行正确干预，则显得更为必要。IFI的实验室诊断包括组织病理、病原菌培养和抗原抗体的血清学检测，以及聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、质谱和荧光原位杂交等新的分子生物学方法。本文就近年SOT术后常见IFI的流行病学及实验室诊断方法的近况进行综述。

1 隐球菌感染

1.1 流行病学：目前，自然界中发现的隐球菌已超过50余种，最常感染人类并导致深部真菌感染性疾病的主要是新生隐球菌与格特隐球菌，格特隐球菌更容易引起免疫功能正常人的感染。新生隐球菌感染与宿主的细胞免疫关系密切，T细胞功能受损是导致病变急剧恶化及播散。器官移植是隐球菌病重要危险因素之一。文献报道隐球菌是仅次于假丝酵母（又称假丝酵母菌）、曲霉属引发SOT患者术后感染的第三大侵袭性真菌［2］。近十年的资料显示SOT患者平均发病率2.8%，移植到发病的中位数时间是21个月。经证实52% ～ 61%的隐球菌感染患者有中枢神经系统 （central nervous system，CNS） 受累和播散性感染，25%有真菌血症，病死率高达72.7%［3-4］。在所有SOT患者中，肾移植术后患者最易合并隐球菌病，其次为肝移植、心脏移植及肺移植。肾移植患者在免疫抑制治疗早期的危险性最高，隐球菌病的发生率达3% ～ 4%［5］。总之，SOT患者感染隐球菌危险因移植种类的不同而呈现明显的差异。

1.2 形态特征：酵母细胞通常直径为4 ～ 10 μm，可呈球形、卵圆形，为窄基出芽，产生特征性厚荚膜，偶尔会出现荚膜不完整，当酵母细胞出现不能相互接触时，应怀疑有荚膜存在。

1.3 实验室诊断：隐球菌病实验室诊断成功很大程度上取决于临床标本的采集和方法的选择正确与否，对于免疫功能受损的隐球菌病的诊断评估是否存在散播性感染，需进行血、脑脊液培养以及血液和脑脊液中隐球菌抗原的检测。只有怀疑存在肿瘤才需做活检。组织病理检查通过证实存在荚膜包被的酵母菌型，从而帮助建立诊断。

1.3.1 隐球菌直接镜检：脑脊液墨汁染色涂片镜检是诊断隐球菌脑病最直接、经济而快速的诊断方法。通常，这种方法对于痰或其他细胞数量很多的标本并不适用。墨汁染色具有快速的优点，但灵敏度稍低，在非获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）患者阳性率只有 50%［6］。

1.3.2 隐球菌培养：真菌培养和鉴定依然是诊断隐球菌病的金标准，血、脑脊液和体液培养确定致病菌菌种，进行药敏试验，对治疗均有重要的意义。但需培养3 ～ 7天。然而，在这种严重感染的情况下，由怀疑到诊断的延迟往往是不可接受的，因此，在获得培养结果之前抗原检测阳性可提示存在隐球菌感染。

1.3.3 血清学检查：血清及脑脊液中的隐球菌荚膜多糖抗原检测方法已有20余年了，但存在特异性和敏感度不足等缺点。侧流免疫层析法检测隐球菌荚膜多糖抗原，由于其操作简单、快速、准确，已成为目前临床诊断隐球菌感染的重要方法之一。对于SOT受者脑脊液隐球菌抗原阳性检测结果强烈支持隐球菌脑膜炎的诊断［4］，肺隐球菌病患有84%血清隐球菌抗原检测阳性。但血清隐球菌抗原检测阴性结果不能用于排除隐球菌病的诊断［7］。

1.3.4 组织病理学检查：对于SOT术后合并隐球菌感染的患者，组织病理学检查通过染色可查见病灶或巨噬细胞内可见带有荚膜的隐球菌。隐球菌病患者常规的组织采集部位包括肺组织、淋巴结、皮肤及其他病变组织，取样时应尽量避开血管及坏死组织。目前，临床常用的隐球菌组织染色方法包括HE染色、PAS染色和GMS染色，它们各具特点。以新型隐球菌为例，HE染色呈淡粉红，但轮廓模糊，不易辨别；PAS法呈紫红色；六胺银法染色呈黑褐色，中央留白。黏液胭胆红染色可以给荚膜染色，这有助于区分隐球菌酵母和具有相似特征的其他酵母菌［8］。

2 假丝酵母菌

2.1 流行病学：在SOT受者中假丝酵母菌是最常见的侵袭性真菌感染的致病菌。在器官移植受者与非器官移植患者中导致假丝酵母菌菌血症的因素是相似的，假丝酵母菌主要通过3种途径进入血液包括：胃肠道黏膜屏障、血管内导管以及局部感染病灶散播（如肾盂肾炎）。在器官移植受者中，根据移植种类还能对侵袭性假丝酵母菌病的危险程度分层。例如，肝移植和胰腺移植受者侵袭性假丝酵母菌感染的发病率高于肾移植受者。最近有证据充分的供体相关的假丝酵母菌感染的报道。这些情况主要发生在肾移植受者中，表现为血管吻合口假丝酵母菌感染，这一菌株与移植时从供体器官分离出的假丝酵母菌相同。尽管少见，但也有出现严重感染的可能。

2.2 形态特征：假丝酵母菌主要以单细胞酵母形式存在，以芽生孢子方式增殖，芽生孢子形态多变，从圆形到椭圆形，再到细长形。除光滑假丝酵母菌外，大多形成假菌丝，少数形成真菌菌丝及厚壁孢子。

2.3 实验室诊断

2.3.1 假丝酵母菌培养：血液中出现了假丝酵母菌，决不应视为污染，而应尽快寻找感染源。假丝酵母菌属正常菌群，在患者因疾病或医源性干预导致免疫防御受损的情况下，可以侵入组织，并产生危及生命的病理反应。由于环境污染、定植或实际的疾病过程，假丝酵母菌属可存在于临床标本中。准确诊断需要正确处理临床标本.血液培养对于侵袭性疾病的诊断是必不可少的，尽管血培养阳性率在50% ～ 70%。TRANSNET实体器官移植受者的队列研究中，639例患侵袭性假丝酵母菌病的患者64%表现为假丝酵母菌血症，11%为尿路感染，9%为腹膜感染。血培养以外的其他需要鉴别定植与感染。

2.3.2 血清学检查：尽管现代血培养阳性率已达70%，但仍有部分常规血培养阴性的侵袭性感染患者，因此，培养以外的其他诊断试验具有巨大的潜在价值。现今使用的非培养方法中检测许多真菌细胞壁中的 1，3-β-D- 葡聚糖［9］。有报道［10］肝移植后侵袭性假丝酵母菌感染患者中，1，3-β-D-葡聚糖检测灵敏度75%、特异性65%、阳性预测值为17%，阴性预测值为96%。由此说明该实验对SOT受者具有较高的阴性预测值。

2.3.3 组织病理：假丝酵母菌侵袭性感染的组织常常引起化脓性炎症反应，有时形成由多核白细胞和单核细胞组成的脓肿。假丝酵母菌侵袭组织时大部分菌株会形成假菌丝和真菌丝。假菌丝实际是细长的芽生孢子链，并不是从另外一个菌丝上分枝而来。可从分隔处明显的收缩痕迹来进行识别。光滑假丝酵母菌与其他假丝酵母菌不同，其孢子略小（直径2 ～5 μm），且不形成任何一类型的菌丝。小酵母细胞常聚集成簇，与荚膜组织胞浆菌很相似，但HE染色镜下见不到晕轮或假荚膜［9］。

3 曲霉菌感染

3.1 流行病学：实体器官移植后患者侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）的发生排在造血干细胞移植后的第二位，是引起手术失败、病死率增加的主要因素。IA的发生率在不同类型器官移植不同。

肝移植受者中IA发生率为1%～8%，且易发展为播散感染（约超过半数病例发生［11］）。国内报道发生率为1.74%～8.21%［12］，以肺部感染最多见，肝移植受者曲霉菌感染后病死率为83%～88%。肺移植受者中IA发生率为3%～14%［13］，其中半数以上为气管支气管炎或支气管吻合口感染，其次为侵袭性肺曲霉病和有肺外侵犯的播散感染。心脏移植受者IA发生率为1%～15%。通常发生在移植术后36～52周。可能的危险因素为：呼吸道分离出曲霉菌、再次移植、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染、移植后需血液透析。肾移植受者中IA发生率为0%～0.7%，最高4%，相比其他器官移植受者的发生率较低。

3.2 形态特征：① 分隔菌丝，直径3～6 μm；② 双叉分支（即从母体分出的菌丝宽度相当），呈45℃。

3.3 实验室诊断

3.3.1 直接镜检：用显微镜直接镜检新鲜标本（支气管灌洗液、痰、组织抽吸物和其他样本），用10%氢氧化钾做悬载剂，光镜下可见分隔，分叉呈45℃菌丝。虽然不能鉴定菌种，却能为真菌感染进行初步诊断。但该方法不敏感，只有在疾病进展期才能检测到。

3.3.2 培养：曲霉菌在自然环境广泛存在，容易造成污染。当曲霉菌分离自无菌标本和分离自侵袭性曲霉病的高危患者时需要鉴定菌种。分离自免疫功能正常非无菌部位标本曲霉菌可能与疾病无关。

3.3.3 血清学：半乳甘露聚糖 （galactomannan，GM）是曲霉菌细胞壁上主要的多糖组分，也存在于大部分青霉属和其他丝状菌中，其可在菌丝生长的过程中被释放出来。BioRad的酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）商品化的GM试验已被很好地验证,这个实验数据使GM试验也被纳入了EORTO/MSG制定的免疫抑制患者中侵袭性曲霉病诊断规定的修订版，该标准推荐的GM试验检测标本包括血浆、血清、支气管肺泡灌洗液或脑脊液，基于一项Meta分析［14］，使用光密度指数为0.5作为诊断侵袭性曲霉病的临界值，血清GM试验的敏感度和特异性分别为71%和89%，阳性预测值（positive predictive value，PPV）较低，为26 ～ 53%，但阴性预测值（negative predictive value，NPV）较高，为 95 ～ 98%。因此，建议GM试验更多的作为排除曲霉病的筛选指标，而不是诊断指标。在实体器官移植的患者中通常出现假阴性及假阳性的结果。GM实验的假阴性结果与先前使用抗真菌药物有关（44%的肺移植患者出现假阴性GM试验结果）。在术后早期，肺移植及肝移植患者通常出现假阳性的GM实验结果（分别为9% ～ 13%，20%）。可能与原发疾病及β受体阻滞剂的使用［5］。

3.3.4 组织病理学［15］：侵袭性曲霉感染病的组织病理学特征为感染跨越组织平面的进展。感染的一个标志为血管侵袭伴随后梗死和组织坏死。在HE染色中曲霉菌丝清晰可见，无色，宽2～4μm，分隔和分叉成45℃，组织血管破损处形成放射状、似轮辐的结构，菌丝彼此平行。在坏死组织中GMS染色更为理想。在侵袭性感染中，曲霉菌是唯一在体内可沿菌丝产生分生孢子的真菌。慢性感染时，短而扭曲的菌丝宽度12 μm，分生孢子头偶尔可形成于空气暴露区域中（如肺空洞、胸模内及鼻黏膜中）。黑曲霉会产生大量草酸钙结晶，如果发现草酸钙结晶应考虑黑曲霉菌感染。

4 肺孢子菌感染

肺孢子菌属于酵母样真菌，可存在于细胞外，具有宿主专一性。现有证据证明，肺孢子菌局限于哺乳动物的肺组织，免疫系统正常的个体可能存在无症状的肺部定植，但当免疫受损时，可导致其在肺泡中增殖，所有肺孢子菌均不能在哺乳动物的肺外传代培养。

4.1 流行病学：SOT受者的肺孢子菌感染表现为机会性肺炎。宿主对肺孢子菌的免疫防御较复杂。移植受者感染肺孢子菌肺炎的危险因素主要为CD4细胞数量和功能、皮质类固醇、甲氨蝶呤、钙调磷酸酶抑制剂如环孢素和他克莫司，以及酶酚酸酯等免疫抑制剂的长期应用有关。据报道，在未接受预防情况下，5 ～ 15%接受SOT患者会发生肺孢子菌肺炎（pneumocystis carinii pneumnia，PCP）。通常发生PCP风险最高的时期在术后1 ～ 6个月期间。接受最大强度免疫抑制方案的患者发生PCP的风险最高［16］。已有报道在SOT受者感染PCP中大多数为肾移植受者，并出现群体性暴发［17］。另有报道大部分肺孢子菌定植于肾移植病区内，可在移植的两年后检测到病原菌［18］。常规抗菌预防治疗已经明显减少肺孢子菌肺炎的发病率。

4.2 实验室诊断：PCP是由耶氏肺孢子菌引起的呼吸系统的机会性真菌感染，由于肺孢子菌肺炎临床症状没有特异性，传统确诊主要依靠形态学鉴定，通常以肺组织、灌洗液或诱导痰发现包囊和滋养体为金标准。主要染色有GMS、钙荧光白、甲苯胺蓝。这些方法具有较高的特异性，往往达到100%。然而，它们的灵敏度相差很大，从33%到100%不等，这取决于染色和使用的样品。最近的一项 Meta分析表明［19］，检测血清1，3-β-D-葡聚糖法对耶氏肺孢子虫肺炎诊断的敏感性和特异性分别为94.8%和86.3%，可用于鉴别感染与定植［20］。但该法的假阳性率高。随着分子生物学的发展，使用耶氏肺孢子菌DNA扩增来诊断，已经越来越多成为临床常规检测手段。但尽管灵敏度高，使用此法确诊需要和临床症状结合，因为定植也会被这种高敏感度的分析检测到。

5 镰刀菌感染

5.1 流行病学：镰刀菌是环境中普遍存在的植物致病菌，如土壤、水以及腐烂物中。移植或强烈化疗后，镰刀霉菌无性孢子经鼻旁窦和肺吸入可引起鼻窦肺感染并伴有血管侵犯和梗死，或发展为播散性感染。与曲霉菌相反，在免疫力受损的宿主，皮肤完整性的破坏是镰刀霉菌播散性感染的最常见途径。不同进展阶段的皮肤病变、真菌血症、鼻脑受累征、肺炎、内源性眼内炎或合并发生这些病变都是播散性镰刀菌病的常见临床症状，与侵袭性曲霉病不同的是在镰刀菌播散性感染的患者血液中镰刀菌的分离率接近60%。多个移植中心报道，移植受者致命性丝状真菌感染中，镰刀霉菌感染占第2位，仅次于曲霉菌感染。

5.2 形态特点：镰刀菌属于透明丝孢霉，这些霉菌具有无色、有隔的菌丝，产生无色或着色的分生孢子。菌丝通常不规则，随机排列，直径跨度大，为2 ～ 8 μm，特征性地呈45℃和90℃分枝。

5.3 实验室诊断：侵袭性镰刀病的感染也很难诊断，它通常需要结合临床症状、培养结果和影像学结果进行综合分析。但镰刀菌常可在免疫功能低下或免疫抑制患者的血液、指甲和皮肤破损处分离培养出来，从无菌部位检出镰刀菌或者显微镜检证实组织中发生侵袭性生长是诊断侵袭性镰刀菌病最为有力的证据。镰刀病可产生曲霉半乳甘露聚糖检测中发生交叉反应的外抗原，使GM试验阳性。1，3-β-D-葡聚糖是大多数真菌细胞壁上重要多糖，虽然不是镰刀菌存在的特异性标志物，但是研究表明在镰刀菌引起的菌血症和肺炎患者血液中能检测到［21］。因此，临床诊断时，应结合1，3-β-D-葡聚糖的监测结果、临床症状和其他一些诊断结果。

6 马尔尼菲青霉感染

马尔尼菲青霉菌是青霉属中唯一的温度依赖性双相菌种。在人体组织内以及37℃富营养的培养基上呈酵母细胞样，而在室温下或在肺空洞内生长者则呈菌丝体状。酵母体在活体内可逃避宿主免疫系统，因此，菌丝体到酵母体的转变是马尔尼菲青霉菌感染发病机制的前提。

6.1 流行病学：马尔尼菲青霉菌最常见于艾滋病患者，近年来马尔尼菲青霉菌病已继结核病和隐球菌病之后成为东南亚艾滋病患者第3位最常见疾病 。也见于有基础疾病，如结缔组织病、糖尿病、恶性肿瘤、器官移植、使用过免疫抑制剂等导致免疫功能不全的患者。马尔尼菲青霉病好发于免疫功能低下人群，绝大多数为播散型感染，局限型感染极罕见。

6.2 实验室诊断

6.2.1 培养［22］：马尔尼菲青霉菌可感染血液、骨髓、皮肤、肺、肝脏、淋巴结及多系统部位。以骨髓和淋巴结活检最敏感，其次是血液和皮肤培养。培养通常需要4 ～ 7天的时间，有时候可能需要几个星期。

6.2.2 组织病理学：在流行病学背景下，培养阳性前组织病理学可初步诊断马尔尼菲青霉菌感染，通过对血或骨髓样本wright染色的显微镜检查 或皮肤或淋巴结活检涂片Giemsa染色、或支气管肺泡灌洗液wright染色显示卵圆形的酵母样细胞，长度为2.5 ～ 5.0 μm。组织细胞内（血液或骨髓中位于单核细胞内）不出芽，形成明显的中央分隔，以分裂方式繁殖（关节分生孢子样）；在组织细胞外，酵母样细胞可长达8 μm，可有多个分隔，有时卷曲。用GMS和PAS染色效果好。用HE染色时，常被误认为有荚膜，所以此菌在细胞内与荚膜组织胞浆菌荚膜变种很相似。

7 小 结

侵袭性真菌已成为器官移植患者常见的合并症，绝大多数深部真菌病起病隐匿、预后凶险，患者无特异的临床表现，很难与其他侵袭性疾病区分。实验室检查是诊断真菌感染的重要依据。目前侵袭性真菌感染的诊断分为3个层次：确诊、拟诊和疑似。主要从宿主因素、临床标准和微生物学证据3个方面进行综合评估。真菌学证据主要包括直接或间接检测到真菌感染存在。其中微生物学证据是诊断的关键，深部真菌实验室诊断方法主要包括镜检、培养、血清学诊断、组织病理学检查和分子生物学方法。组织病理对于深部真菌感染的诊断具有重要意义。在组织切片中发现真菌菌丝和孢子，是对深部真菌感染诊断有力的证据，其结果可能比直接镜检和培养的诊断意义更大。根据病原真菌在组织内的表现，可将病原真菌鉴定到属的水平，与培养结果结合可以区分感染和定植。血清学检查能快速得出结果，为临床医生提供快速的诊断辅助依据。分子生物学检测手段是国内外真菌感染诊断研究的热点，具有特异性强、敏感性高的优点。血清免疫学和分子生物学等非培养法虽有了较大的进展，但敏感性和特异性仍难以满足临床诊断的需要。侵袭性真菌感染的诊断技术仍然十分有限，各种检测方法各有优劣，为达到早期诊断的目的，应尽可能地联合应用多种检测技术来进行诊断。根据具体的情况，做到常规检查与重点检查相结合、传统检查与新型检查相结合、一般检查与特异性检查相结合、人工检查与系统分析相结合，力争在很短的时间内鉴定出致病真菌的种类，为临床提供既快速又可靠的实验室诊断结果。