盐胁迫下宁夏枸杞根系Na+、K+平衡及抑制剂对其影响的研究

朱志明，毛桂莲，许 兴，王 盛，郑 蕊，杨淑娟

(1.宁夏大学农学院， 宁夏 银川 750021； 2.宁夏大学生命科学学院， 宁夏 银川 750021；3.宁夏大学西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室， 宁夏 银川 750021)

近年来，土壤盐渍化问题日益突出，全球近20%的耕地都不同程度的受到土壤盐碱化的影响，成为农业生产及生态环境中一个全球性问题[1]。盐胁迫对植物的伤害主要表现为Na+在细胞中大量累积，使细胞内代谢活动受到抑制，离子平衡被破坏[2]。高Na+通过直接干扰和抑制细胞质膜对营养元素(K+和Ca2+)的吸收和转运，造成离子失衡和营养缺乏。有研究表明,在盐胁迫下植物能否维持细胞内的离子平衡，尤其是Na+/K+平衡，是其耐盐性强弱的决定性因素[3]。Zhu J K等[4]研究了植物细胞Na+/K+平衡的信号转导和分子调控网络；檀叶青等[5]对胡杨细胞Na+/K+平衡及其耐盐机理方面做了大量研究，揭示了耐盐林木通过其质膜上的Na+/H+逆向运输系统，将胞内过量Na+排出胞外，同时抑制K+外排，保持细胞内较低的Na+/K+，从而增加其耐盐性。盐生植物宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)具有耐盐碱、耐旱、繁殖能力强等特点，是宁夏特色优势产业之一，对于其耐盐性及耐盐机理，毛桂莲等[6]研究了NaHCO3胁迫下3种灌木Na+、K+、Ca2+的吸收及转运，以及碱胁迫对宁夏枸杞叶中Na+、K+、Ca2+动态变化的影响[7]。但对于NaCl胁迫下宁夏枸杞根系Na+/K+调控机制，以及耐盐机理仍未明确，且目前大多研究集中在离子平衡静态方面，对其动态变化研究鲜有涉及。非损伤微测技术在不损伤植物体的情况下，能获得持续、稳定、活体离子流信息，为研究离子动态变化提供了便利。本试验采用非损伤微测技术，探讨盐胁迫下宁夏枸杞根系Na+、K+离子平衡及抑制剂对其影响，以期为宁夏枸杞耐盐机理及盐碱地枸杞栽培研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为宁夏育新枸杞公司育种基地的枸杞品种“宁杞1号”。

1.2 材料培养及处理

取一年生“宁杞1号”硬枝扦插苗为试验材料，采用沙土(沙土比1∶1)于2016年4月在宁夏大学农科基地温室培养，定期浇水，保持土壤湿度。并每两周浇一次全营养液，于2016年5月中旬选取长势良好一致的土培苗转入含1/4浓度Hoagland营养液的水培瓶(口径15 cm，高25 cm)中进行水培，每瓶5株，定期更换新鲜营养液。整个试验期间按水培常规管理方法进行管理。待新根长出后，选取长势一致的幼苗，在含1/4浓度Hoagland营养液中加入盐溶液进行处理。每天更换含预定处理盐浓度的营养液以保证处理期间盐浓度保持不变。每个处理重复10瓶。具体处理方法见表1。

表1 试验处理方法

注：表中处理D、E是将NaCl处理7 d的枸杞根系放在抑制剂中孵育30 min后测定离子流速。

Note: The treatments of D and E in the table are the determination of the ion velocity after the NaCl treatment of 7 d in the root of theLyciumbarbarumL. and incubated with 30 min inhibitor.

1.3 测定项目及方法

1.3.1 Na+、K+含量的测定 分别取处理24 h、7 d后的枸杞根系烘干粉碎后称取50 mg干样，用10 ml去离子水沸水条件下浸提60 min，采用原子分光光度计(TAS-990,Purkinje General,北京)测定根系中Na+、K+含量[8]。每个处理重复5次。

1.3.2 Na+、K+离子流速的测定 利用非损伤微测技术(NMT)检测(旭月(北京)科技有限公司NMS系统(Younger USA LLC, Amherst, MA 01002, USA))测定根细胞Na+、K+离子流，具体检测方法及原理参照相关文献[9-11]。

测定过程中将选择性离子电极在尖端不触碰根表面的情况下尽量靠近根面。选择性离子电极以此为起点，沿x、y、z轴三个方向进行三维立体往复测试。电极运动一次间距(从近待测根表面一端到远待测根表面一端)为30 μm，运动频率为0.3～0.5 Hz。测试离子流速可通过Fick′s 扩散法则计算得出，公式如下:

J=-D(dc/dx)

式中，J为x方向的离子流；D为在特定介质中离子或分子扩散常数；dc/dx为离子浓度梯度。离子流数据根据旭月公司提供的Mage Flux在线软件( http: www．youngerusa．com)计算得出。本试验中阳离子外流表示为正值，内流为负值，且所得数据是净离子流速，即内流与外流相抵消后的离子流速。

K+流速测定：微电极前端灌充有15～25 μm选择性的K+的液态交换剂，其后灌充10 mm左右的电解液柱(100 mmol·L-1KCl)，将电极固定器上的Ag/AgCl丝从电极后面插入，使其与电解液接触，固体电极作为参比电极。玻璃微电极需要校正后使用。K+校正液为0.05、0.1 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1缓冲液(K+测试液为0.1 mmol·L-1)。

Na+流速测定：微电极前端灌充15～25 μm选择性Na+的液态交换剂，其后灌充有10 mm左右的电解液柱(250 mmol·L-1NaCl)，玻璃微电极器上的Ag/AgCl丝从电极后面插入，使其与电解液接触，固体电极作为参比电极。玻璃微电极需要校正后使用。Na+校正液为0.5、0.9 mmol·L-1和5.0 mmol·L-1缓冲液(Na+测试液为0.9 mmol·L-1)。

H+流速测定：微电极前端灌充15～25 μm选择性的H+的液态交换剂，其后灌充有10 mm左右的电解液柱(40 mmol·L-1KH2PO4+15 mmol·L-1NaCl)，玻璃微电极器上的Ag/AgCl丝从电极后面插入，使其与电解液接触，固体电极作为参比电极。玻璃微电极需要校正后使用。H+校正液为0.1 mM NaCl、0.1 mM MgCl2、0.1 mM CaCl2和0.5 mM KCl(H+测试液为0.1 mM NaCl，0.1 mM MgCl2，0.1 mM CaCl2，0.5 mM KCl和2.5%蔗糖，用HCl和KOH调节pH至5.5)。

1.4 数据处理

离子流检测数据由旭月(北京)科技有限公司的统计软件完成，数据统计分析和作图采用Excel和SPSS1 7.0软件进行。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫下枸杞根系中Na+、K+含量

在盐处理浓度(50、100 mmol·L-1)相同条件下，随着胁迫时间的增加，枸杞根系中Na+含量总体呈升高趋势，其中7 d，100 mmol·L-1处理的Na+含量最高，与其它处理之间的差异显著。在相同的胁迫时间内(24 h)，随着胁迫浓度的升高，不同处理间的Na+含量差异不显著。当处理时间为7 d时，Na+含量总体呈上升趋势，50 mmol·L-1处理与对照差异不显著，100 mmol·L-1处理与对照及50 mmol·L-1处理差异均达到显著水平。同一胁迫时间(24 h)内，随着胁迫浓度的增加，K+含量呈先升后降趋势，不同处理之间的差异显著，且显著高于对照。处理时间为7 d时两种盐浓度处理间的差异不显著；与对照相比，两种盐处理的K+含量均显著升高。同一胁迫浓度下(50、100 mmol·L-1)，随胁迫时间的增加，K+含量呈缓慢上升趋势；长时间的盐处理增加了枸杞根系中K+含量。

图1不同浓度盐处理下钠离子、钾离子含量

Fig.1 Na+and K+contents under different treatments

2.2 NaCl胁迫下枸杞根系中Na+/K+

相同的胁迫时间内，随着胁迫浓度的增加,宁夏枸杞根系中Na+/K+呈先降后升趋势，24 h,50 mmol·L-1处理下Na+/K+最低，比对照下降了38.6%，7 d,100 mmol·L-1处理下Na+/K+比对照下降了18.2%，比同浓度24 h处理增加了16.7%。不同浓度处理与对照的差异显著，Na+/K+在24 h处理下显著低于对照(图2)。相同胁迫浓度下，随着胁迫时间的增加Na+/K+呈上升趋势。

2.3 不同NaCl处理下Na+、K+、H+离子转运

NaCl胁迫下不同处理Na+外排速率均显著高于对照(CK)，外排明显增加。24 h,50 mmol·L-1处理的平均净Na+外排速率最高，较对照增加了83.6%(图3a)。相同胁迫时间内，随着胁迫浓度的增加，平均净Na+外排速率表现为先升后降趋势，且始终高于对照，与对照差异显著。随着胁迫时间的增加，同一胁迫浓度下Na+外排速率降低，胁迫24 h后，不同浓度处理之间的差异显著，处理时间增加到7 d后，不同浓度处理与对照相比差异显著(图3b)。NaCl胁迫下K+外排明显增加，显著高于对照(图3c)。在相同的胁迫时间内(24 h)，随着胁迫浓度的增加，平均净K+流速先增加，后下降，不同浓度间的差异显著。胁迫时间为7 d时，随胁迫浓度增加K+外排持续增加，处理间的差异达到显著水平。7 d,100 mmol·L-1处理的平均净K+外排速率最大，较对照增加了94.8%，较同时间的50 mmol·L-1处理增加了67.3%。在相同胁迫时间内(7 d)，随着胁迫浓度的增加，K+流速呈先下降后上升趋势(图3 d)。H+内流速率(除24 h,50 mmol·L-1处理外)随着胁迫时间和胁迫浓度的增加而显著增加，处理间的差异达到显著水平(图3e)。

图2不同处理下枸杞根系中Na+/K+

Fig.2 Na+/K+under different treatments

图3 NaCl胁迫下枸杞根系净Na+、K+、H+转运

Fig.3 Effect of NaCl stress on Na+,K+,H+fluxes in root ofLyciumbarbarumL.

注：图中数据表示10 min内枸杞根系净Na+、K+、H+动态转运(a,c,e图)及10 min内平均Na+、K+、H+转运速率(b,d,f图)。图中数据为每个测定区域内数个测定位置的离子流速的平均值。

Note: Data are expressed as the Na+,K+,H+flux kinetics on the roots ofLyciumbarbarumL.(a,c,e figure) and the average Na+、K+、H+fluxes ofLyciumbarbarumL. in ten minutes(b,d,f figure). Data are the average of the ion velocity of a plurality of measurement positions in each measurement area.

2.4 两种抑制剂处理下Na+、H+离子流速

图4结果表明，与100 mmol·L-1不加抑制剂处理相比，两种抑制剂处理下净Na+外排速率显著降低，两者差异显著，钒酸钠处理的净Na+外排速率较100 mmol·L-1不加抑制剂的处理降低了74.3%，差异达到显著水平。阿米洛利处理的净Na+外排速率较100 mmol·L-1不加抑制剂的处理降低了77.8%，两者差异显著。 与100 mmol·L-1不加抑制剂处理相比，钒酸钠处理的净H+内流速率降低了15.7%，差异达到显著水平。两种抑制剂显著降低了Na+外排及H+内流速率；矾酸钠抑制剂对H+内流抑制作用更加明显，阿米洛利抑制剂对Na+外排速率影响更明显，两种抑制剂对枸杞根系Na+外排及H+内流具有显著调控作用。

图4抑制剂阿米洛利与矾酸钠处理的枸杞根系Na+,H+转运

Fig.4 Effect of amiloride and vanadate on net Na+,H+fluxes in root ofLyciumbarbarumL.

注：图中数据为每个测定区域内数个测定位置的离子流速的平均值
Note: Data are the average of the ion fluxes of a plurality of measurement positions in each measurement area.

3 讨论与结论

植物体内积累过多Na+会对其产生毒害作用，耐盐植物通过调节细胞内的离子平衡，降低离子毒害进而增加其耐盐性[12]。初始盐胁迫下，枸杞根系中Na+含量增加缓慢，与对照差异不显著，随着胁迫时间及浓度的增加，Na+含量显著增加。结合Na+流速结果分析，初始盐胁迫下Na+外排迅速增加，随着胁迫时间及浓度的增加外排减慢，但始终高于对照，表现为明显的外排。上述结果表明，在短期低浓度盐胁迫下，宁夏枸杞根细胞为了降低Na+毒害，将胞内过多的Na+排出胞外，维持细胞内较低的Na+浓度，从而降低了Na+毒害。

前人研究表明,K+在植物抗盐性中起到重要作用,而高浓度Na+又会诱导组织内K+含量降低，从而造成盐害[11]。本试验中，与未经处理的CK相比，盐胁迫下宁夏枸杞根系中的K+含量会显著增加，K+外流先增加后降低，分析其原因可能是由于初始胁迫下Na+进入细胞会诱发质膜电位去极化[13]，并激活质膜外向整流型K+通道(DA-KORCs)和非选择性阳离子通道(DA-NSCCs)[14]，从而引起K+外流。随着盐胁迫时间延长和胁迫浓度的增加，质膜H+-ATPase降低了质膜的去极化程度,减少了通过去极化激活通道的流失。K+外流由快减慢，进而使胞内含有较高的K+浓度。

植物在盐胁迫环境下维持细胞内较低的Na+/K+平衡对其抗盐性具有重要作用。对耐盐胡杨的研究表明主要通过增加Na+外排，限制K+外流来调节盐胁迫下组织或细胞中的Na+/K+平衡[4，15-16]。本试验中，宁夏枸杞根系中Na+/K+在NaCl胁迫下显著低于对照，表明宁夏枸杞根系能够调节胞内Na+/K+平衡，促进胞内Na+外排，同时抑制K+外流，维持细胞内较低的Na+/K+，进而增加其耐盐性。本试验研究结果与前人在耐盐胡杨上的研究结果吻合。

抑制剂试验结果显示，质膜Na+/H+逆向转运蛋白抑制剂阿米洛利(Amiloride)和质膜H+-ATPase 抑制剂矾酸钠(Vanadate)都显著降低了短期盐胁迫下宁夏枸杞根系的Na+外流和H+内流，表明在盐胁迫下质膜H+-ATPase水解ATP产生的能量将H+泵出，激活了Na+/H+逆向转运体的活性，H+进入胞内的同时，Na+排出胞外[17]。试验结果进一步说明，宁夏枸杞根系能够将胞内过多的Na+排出胞外是源于其体内的Na+/H+逆向运输。此研究结果与前人在木榄植物的研究成果相似[11]。

综合上述，宁夏枸杞根系调控Na+/K+平衡可能有两种方式：一是借助于质膜上的Na+/H+逆向转运蛋白载体将胞质中过量的Na+外排，质膜上的H+-ATPase水解ATP产生能量，将H+从细胞质中泵出,从而产生跨质膜的H+电化学势梯度，H+顺着电化学势梯度进入细胞的同时,Na+逆着电化学势梯度被排出细胞，从而保持细胞内较低的Na+含量；另一方面可能是通过提高质膜H+泵活性来减少K+外流。提高质膜H+泵活性可以在为Na+跨膜外排提供浓度梯度的同时，降低质膜去极化程度，进而减少K+外流。从而保持细胞内较低的Na+/K+，提高其耐盐性。

本试验在前人研究基础上，采用目前较为先进的非损伤微测技术测定了活体植物离子流，可以更为准确地揭示植物体内离子流动态变化规律及植物耐盐机理。然而植物耐受盐胁迫是一个复杂的生理过程，本试验仅涉及了盐胁迫下枸杞根系离子含量及其动态变化，对于其茎叶中离子变化尚未涉及，在后续研究中可进一步设置试验进行深入探讨。

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