白念珠菌黏附基因的研究进展

赵晓霞 冯文莉

(1.山西医科大学，太原 030001；2.山西医科大学第二医院皮肤科，太原 030001)

白念珠菌 (Candidaalbicans，C.albicans，CA.)是人体常见的条件致病真菌，在免疫力低下的患者中可以引起机体浅部或系统性的感染。如艾滋病患者口腔和食管的感染有很高的发病率，可严重降低患者的生活质量；其他因素诸如免疫抑制治疗、重大手术或静脉内置管都可引起系统性念珠菌感染，而且往往是致命性的。在健康的个体，白念珠菌也可以引起慢性的浅表感染，典型的例子就是念珠菌性外阴阴道炎。另外，在许多情况下白念珠菌只是黏附在宿主表面，并不引起明显的疾病，称为定植。由此可见，白念珠菌与宿主之间相互作用的机制十分复杂，尽管在这些作用过程中宿主的因素起着很大的作用，但是，白念珠菌的黏附功能也起了较关键的作用，而与黏附功能相关的黏附素、酶及相关蛋白都是由黏附基因编码的。本文就白念珠菌黏附基因研究的新进展作以下综述。

1 凝集素样序列基因3(Agglutinin-Like Sequence 3，ALS3)

凝集素样序列基因家族 (Agglutinin-Like Sequence，ALS)编码序列高度相似的细胞表面糖蛋白。ALS1-4编码专门用于生殖管和菌丝的黏附素，而ALS5-7和ALS9与芽生孢子相关。最常报道的基因是ALS1，ALS3和ALS5，它们具有广泛的底物特异性，从而介导了对各种宿主成分的依从性，在细胞黏附和宿主侵袭中起重要作用，有助于疾病的进展[1]。

在其编码的蛋白质中，关于Als3p的研究最多，其主要功能是帮助白念珠菌定殖于宿主。Als3p从50末端的信号肽开始，到30末端的糖基磷脂酰肌醇 (GPI)锚定位点结束。ALS3基因的启动子含有两个抑制区 (R1和R2)和两个激活区 (A1和A2)。ALS3基因的表达在生殖管诱导条件下增加，并受多种转录因子调节，包括Rlm1p、Efg1p、Rim101p和Bcr1p[2-3]。

Als3p作为黏附素具有广泛的底物特异性，介导白念珠菌与多种宿主细胞的附着，例如上皮细胞，内皮细胞，细胞外基质蛋白和植入材料 (如导管等)。此外，Als3p与Hwp1p (Hyphal Wall Protein1，1型菌丝壁蛋白)和Eap1p (Enhanced Adherence to Polystyrene，聚苯乙烯黏附增强蛋白)一起构建网络，从而形成互补的黏附功能。另外，白念珠菌Als3p具有高度保守的淀粉样蛋白形成序列，这使得白念珠菌更趋向于聚集成群，而不是黏附于人类细胞[4]。此外，研究发现ALS3介导白念珠菌对金黄色葡萄球菌的依附并促进白念珠菌和戈登链球菌 (Streptococcusgordonii,S.gordonii)形成混合物种生物膜[5-6]。白念珠菌Als3p与人细胞的黏附需要肽结合腔 (PBC)，Als3pPBC的突变导致白念珠菌无法黏附于上皮细胞和脐静脉内皮细胞，类似于无效突变体[7-8]。相比之下，Cleary等[9]发现Als3p对于流动模型下的黏附是不必要的，部分原因是因为在这样的条件下，菌丝特异性基因如ECE1和HWP1仍然被适当诱导。这是迄今为止关于Als3p在黏附方面起次要作用的唯一报道。

除了帮助白念珠菌定植宿主外，Als3p也是真菌入侵宿主所必需的。有研究证实它通过与人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)上的N-钙粘蛋白或口腔上皮细胞上的E-粘钙素 (Ecadherin)结合诱导内吞作用[10]。Als3p还可以结合独特的受体，然后侵入人脑微血管内皮细胞 (HBMECs)[11]。在白念珠菌和光滑念珠菌的阴道上皮共感染模型中，白念珠菌Als3p被确定为促进光滑念珠菌的侵袭、定植和组织损伤所需的因子[12]。

Morenoruiz 等[13]认为，白念珠菌Als3p作为抗宿主防御的高分子量激肽原 (HK)受体，可促进白念珠菌生物膜形成以维持细胞壁功能。并且，ALS3与白念珠菌从哺乳动物宿主中的血红蛋白、铁蛋白和转铁蛋白中获得铁有密切关系[14-16]。促进白念珠菌与宿主细胞铁蛋白的结合，以获得铁作为营养物，从而在很大程度上逃避了宿主的攻击。

ALS3与白念珠菌生物膜形成密切相关，其在大多数实验室生物膜模型系统中表达均上调[17]。白念Als3null突变体通常在RPMI1640或Lee's培养基中形成菌丝，在小鼠系统性感染模型中具有野生型毒力，但缺乏生物膜形成。ALS3的过表达在体外和大鼠静脉导管模型中弥补了bcr1D/D突变体中的生物膜形成的缺陷[18]。在有机硅生物材料上，人血清促进白念珠菌生物膜的生长，并且ALS3的表达增加[19]。

Als3p是参与白念珠菌致病过程的重要因子之一，近年来成为抗白念珠菌病的疫苗和抗体的特定靶标。Als3p特异性抗体包括单克隆抗体 (MAb)3-A5，MAb113和scFv3，此外，还有MAbC7，MAb3D9.3和MAb2G8等。靶向Als3pN末端的NDV-3疫苗已进入2期临床试验[20-23]。这些抗体和疫苗未来有望成为高效的新型抗真菌药物。

2 1/2型菌丝壁蛋白(Hyphal Wall Protein 1/2，Hwp1/2)

白念珠菌的菌丝胞壁蛋白基因1 (HWP1)编码真菌细胞壁蛋白，该蛋白是菌丝发育和酵母黏附于上皮细胞、生物膜形成和毒力所需的，也是第一个被发现在生物膜形成过程中所需的蛋白质。HWP1基因缺失的白念珠菌不能与人类口腔上皮细胞形成由稳定的共价结合介导的黏附，但对白念珠菌总的黏附率影响却较小。研究表明，Hwp1可以通过与Als1p和Als3p结合介导白念珠菌菌丝之间的黏附，这对于生物膜的形成至关重要。

Hwp1由Kex2内切蛋白酶调节，其本身也调节白念珠菌蛋白酶的活性。此外，Hwp1在N末端富含谷氨酰胺残基，这些是哺乳动物转谷氨酰胺酶的底物，在体外形成Hwp1与宿主细胞表面蛋白之间的交联，从而介导菌丝对宿主上皮细胞的稳定附着。在口腔白念珠菌病患者和阴道念珠菌病患者的临床分离菌株中，均检测到Hwp1较高的表达[24]。

在HWP1中，激活和抑制黏附均涉及到的368 bp区域，称为HWP1控制区域 (HCR)，位于其转录起始位点上游1 410 bp处，其介导的激活和抑制局限于由转录因子Nrg1p和Efg1p靶向作用的不同HCR区域。但Kim等[25]认为，HCR不仅确保Hwp1在细胞群体中的均匀表达，HCR的独立表达也存在。此外，HWP1的长5'基因间区域上游在产生mRNA亚型中起作用，而mRNA亚型对形态学特异性基因的表达十分重要。 Staab等[26]研究发现，缺乏Hwp1将影响白念珠菌从小鼠肠道向血流的迁移。

另外，真菌血红素 (FC)、抗血栓药物舒必特、乳酸杆菌代谢物、合成抗菌肽dermaseptin-S1、健康阴道相关的优势乳杆菌种L.crispatus、光动力疗法、十一碳烯酸等可以抑制菌丝特异性基因 (ALS3，HWP1)的表达[27-33]。卷烟烟气冷凝物 (CSC)可增加HWP1、EAP1的表达[34]。HWP1基因型影响真菌细胞形态结构以及其与小胶质细胞的相互作用，而生物膜的形成不受影响[35]。

Hwp2是GPI锚定的细胞壁蛋白，它与白念珠菌的毒力、黏附性、生物膜形成、过氧化氢应激反应密切相关[36]。HWP1、HWP2和RBT1的表达是菌丝特异性的，在不透明细胞交配过程中会上调。Peter Hayek等[37]鉴定的Hwp2的AIVVT序列与Als9具有96%聚集潜力的IIVVTT序列具有高度相似性，并且与Rbt1和Hwp1中的相似序列具有高度同源性。Hwp2与Rbt1、Hwp1的多重序列比对表明，在每种蛋白质中发现两次相似的37个氨基酸长序列相似区域 (大于60%同一性)，这种37个氨基酸长序列可能是黏附和侵入性生长中涉及的关键序列。

3 聚苯乙烯黏附增强蛋白1 (Enhanced Adherence to Polystyrene 1，Eap1)

白念珠菌Eap1p是GPI-CWP家族的成员。EAP1在酵母和菌丝细胞中均表达，并在酵母表型转换期间被差异调节。EAP1的表达受正负调控，Sir介导的沉默使其在细胞间表现出高度的异质性。Eap1p有助于生物膜形成，其不同区域介导了白念珠菌对不同底物的黏附，例如与一般上皮细胞、聚苯乙烯的黏附[38]。其N-末端结构域促进细胞-细胞接触和对哺乳动物细胞的黏附，Ser/Thr富集重复区有助于聚苯乙烯黏附。EAP1的表达增强了酿酒酵母对HEK293肾上皮细胞和聚苯乙烯的附着，并且在介导酿酒酵母和白念珠菌细胞之间的相互作用中发挥着作用。EAP1基因缺失的菌株对聚苯乙烯和HEK293肾上皮细胞的黏附下降近50%，并且在体外只能形成由数层酵母细胞组成的被膜。与Als3p类似，Eap1和Hwp1可以促进白念珠菌结合到S.gordonii。S.gordonii的特征是表面具有类似淀粉样蛋白序列的蛋白质，但Als3p和Eap1的黏附功能不依赖于淀粉样蛋白形成[12]，表明这种结合是靠N端效应结构域而不是靠重复单位介导的。

4 IFF/HYR家族

白念珠菌IFF/HYR基因家族编码12种蛋白质 (“IFF”代表“IPF家族F”，“HYR”表示“菌丝上调蛋白质基因”)，在这12个成员中，有11个被鉴定为GPI锚定蛋白，从而形成了真菌细胞壁蛋白最主要的一类，所有蛋白质均显示高度保守的360-氨基酸N-末端结构域[39]。Iff2/Hyr3是首个通过二硫键与细胞壁相连的GPI修饰蛋白。IFF/HYR基因家族中Iff1/Rbr3，Iff2/Hyr3，Iff3，Iff5，Iff7/Hyr4和Iff9共享41至51个氨基酸长的Iff特异性串联重复序列[40]。该家族包括菌丝特异性蛋白Hyr1和Iff11，Iff11代表了一种分泌蛋白，其缺失导致细胞壁显著改变，表明该蛋白质在细胞壁组织和/或酶功能中发挥作用[41]。在完整细胞上进行的免疫荧光显微镜检查表明，Iff2/Hyr3 (580个氨基酸)，Iff3，Iff5和Iff6在细胞表面暴露，而Iff8 (具有最小的Ser/Thr富集结构域，340个氨基酸)嵌入葡聚糖聚合物中。这些蛋白质的预测长度表明，蛋白大小对是否可以暴露于细胞表面有直接影响。Iff/Hyr家族蛋白质的分子底物尚未确定，但它们具有重要的临床意义。IFF4的过度表达增强了菌体对塑料和上皮细胞的黏附[42]，IFF4的无效突变体对塑料的黏附性降低[43]。在动物模型中，IFF4的过表达和低表达均导致毒力降低，表明特定的表达水平是最大毒力所需的[44]。 Hyr1参与抵抗中性粒细胞对菌体的杀伤作用，抗Hyr1抗体(AB)可增强小鼠对播散性念珠菌病的免疫[45]。

5 1型整合素基因 (Integrin 1, INT1)

INT1基因编码的蛋白质有1 659个氨基酸，其在体外和体内均参与对上皮细胞的黏附。Int1是一种白念珠菌细胞表面蛋白，与脊椎动物的整合素具有部分的相似，起初被认为是白念珠菌与宿主细胞发生黏附的受体。Orellanamuoz等[46]发现Int1的C端对于维持细胞质分裂过程中双重septin环的稳定性是必不可少的。Int1和Sep7的共同作用可维持细胞倍性。INT1和SEP7突变体的核分裂和胞质分裂都不能正常发生。目前已经确定Int1是一种新的septin调节剂，其可能作为支架蛋白来稳定septin。Int1和Sep7通过充当Lte1 (MEN的激活剂)的扩散屏障而在维持基因组稳定性方面发挥作用。

Shahin-Jafari等[39]的研究结果强调了900 MHz移动电话辐射对α-INT1基因扩增或序列变异的无效性。在体内，Int1中的基序1的赖氨酸K805/K806对于中心静脉导管中的生物膜形成是必需的，针对基序1的IgG抗体可抑制生物膜形成[47]。将INT1转入酿酒酵母中表达可以使酵母细胞与HeLa细胞发生黏附；在白念珠菌中破坏INT1的两个拷贝可减少菌体对HeLa细胞的黏附；INT1对于小鼠模型中菌丝形态发生和毒力是必需的，将白念珠菌的INT1基因敲除后可以抑制菌丝的生长、减弱菌体与上皮细胞的黏附以及降低白念珠菌对小鼠的致病力[48]。

6 结 语

白念珠菌的黏附特性是其致病力的重要因素，也是其致病机制的重要组成部分。目前的研究已经发现了一些黏附相关的基因，他们的表达导致白念珠菌产生一系列表面蛋白、调控因子，从而使白念珠菌产生黏附力，除此之外许多研究也发现黏附基因有许多其他功能，如参与调控细胞的分裂等。而它们真正的作用机制、更多的生理功能以及彼此之间是否存在表达调控尚待深入探讨阐明，以期为研制新的抗真菌药物和真菌疫苗提供理论依据。