c-di-GMP及其对细菌生物膜调控作用的研究进展

全 旭 王鹤龄 张慧彦 许彤彤 王春阳 崔云霞 孟维艳

作者单位：130021长春，吉林大学口腔医院（孟维艳为通讯作者）

环二鸟苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）是细菌内广泛存在的一类重要的第二信使分子，调控细菌的运动性，生物膜形成，细胞毒性，细胞周期，细胞分裂等生理生化过程。生物膜是细菌的一种生存状态，它的形成是一个连续的过程，由生物膜引起得感染普遍存在。本文主要概述了c-di-GMP的代谢和分子调控机制以及c-di-GMP在细菌生物膜形成过程中所起到的调控作用。

一、c-di-gmp的代谢及其分子调控机制

1.c-di-gmp的代谢

1987年，在葡糖醋酸杆菌中发现了环二鸟苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP），并确认其为纤维素合成酶异构激活因子[1]。目前已知c-di-GMP是由2分子GTP在含有GGDEF结构域的二鸟苷酸环化酶（DGCs）作用下形成，而在含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶（PDEs）的作用下被降解为pGpG 或 2 个分子的 GMP[2，3]。

（1）CCDEF结构域与c-di-GMP的合成

1995年，在新月杆菌中PLeD的C端发现了GGEDF结构域，报道了其高度保守的Gly-Gly-Asp-Glu-Phe序列基序，但并未描述其生化特性。2001年，Pei等[4]对GGDEF的序列和结构进行了生物信息学分析，提出GGDEF结构域是二鸟甘酸环化酶（DGCs）起催化作用的核心结构域，并推测GGDEF是GTP的结合位点。PleD[5]是最早发现的DGC，Paul等证实了含有GGDEF结构域的PleD可将 GTP合成为 c-di-GMP。GG（D/E）EF基序是GGDEF 结构域的活性位点[2，6，7]，又称为 A 位点，它与底物GTP结合，催化c-di-GMP的合成。在该活性中心上游的5个氨基酸残基处有一个RXXD基序，称为抑制位点（I位点）。当合成的c-di-GMP与I位点结合时，GGDEF结构域蛋白产生非竞争性抑制剂反馈抑制DGCs的催化反应。这种反馈调节可以使细胞内c-di-GMP浓度处于一个动态平衡[8，9]。大多数GGDEF结构域蛋白质都具有I位点，如PleD及WspR。但也有的GGDEF结构域蛋白质没有I位点[9，10]，例如野油菜黄单胞菌中的XCC4471蛋白，其包含的GGDEF结构域并没有I位点，而是通过c-di-GMP二聚体与A位点结合形成XCC4471GGDEF-（c-di-GMP）2复合体竞争性抑制DGCs的活性[11]。

（2）EAL及HD-GYP结构域与c-di-GMP的分解

1986年，Benziman等人在从葡糖醋酸杆菌中提取出PDEs，并证实其可将c-di-GMP水解为线性di-GMP，如 5‘-pGpG，最终水解为单体 pG。EAL[12]通过与金属离子Mg2+或者Mn2=结合激活PDEs的活性，而与Ca2+及Zn2+结合则会抑制PDEs的活性。EAL活性的激活依赖于水合金属簇，它可以水解c-di-GMP的磷酸酯键。HD-GYP[13]结构域属于HD家族，这个家族的成员可水解各种底物。Ryan等证实野油菜黄单胞菌中的HD-GYP结构域蛋白RpfG参与c-di-GMP的降解。在异源宿主中表达时，HD-GYP结构域蛋白RpfG可功能性的取代EAL结构域的磷酸二酯酶（PDE），将HD-GYP结构域蛋白RpfG提纯，可发现其具有磷酸二酯酶（PDE）的活性[14]目前对有酶活性的HD-GYP结构域蛋白的结构特征所知甚少。食菌蛭弧菌中的Bd1817是第一个被确定结构的HD-GYP结构域蛋白，由于Bd1817其GYP基序缺乏一个保守的酪氨酸，故并不具有磷酸二酯酶（PDE）活性，在体外也不能和c-di-GMP 结合[15，16]。

2.c-di-GMP的分子调控机制

c-di-GMP的调控是分子水平的，包括：①变构调节酶活性或蛋白质功能；②通过调节转录因子近一步调控基因的表达；③通过直接作用于核糖开关调控基因表达。当细菌感受到周围环境变化带来的刺激时，可通过调控c-di-GMP的合成酶和水解酶来控制细胞内c-di-GMP的水平，不同浓度的胞内c-di-GMP可被c-di-GMP的受体蛋白感知而引起下游分子活动的变化，从而实现c-di-GMP的信号传导。例如c-di-GMP可调控细菌从浮游状态到静止状态的可逆性转变，已证实在大肠杆菌、铜绿假单胞菌及沙门氏菌中，高浓度的c-di-GMP可促使细菌聚集从而形成生物膜，而低浓度的c-di-GMP可促使生物膜分解[17]；遗传筛选也发现c-di-GMP信号传导途径可调控多种动植物病原菌的毒力[18～20]；最近发现c-di-GM与其他核苷酸信号（p）ppGpp可协同调控分枝杆菌的细胞形态，细胞分裂以及全基因组的表达[21]。

与其他核苷酸信号通路一样，c-di-GMP的调控需要其受体蛋白的参与。目前已知的受体主要有两类：效应蛋白和核糖体开关，效应蛋白是c-di-GMP在细菌体内的下游作用靶点如PilZ、FleQ[22，23]。PilZ具有两个保守的氨基酸残基基序RXXXR和D/NXSXXG，当c-di-GMP与含有PilZ结构域的效应蛋白结合时，这两个基序发挥重要作用。如含有PilZ结构域的FlgZ受体蛋白和c-di-GMP结合时，通过与MotCD（促进铜绿假单胞菌群集运动的鞭毛定子）相互作用进而抑制铜绿假单胞菌的群集运动[24，25]。FleQ作为一种新型的c-di-GMP受体，可直接与细菌胞外多糖及鞭毛基因的启动区结合，参与细菌胞外多糖及鞭毛基因的转录调控，从而差异性调节生物膜基质成分的表达[26]。核糖开关是一种RNA顺式作用元件，通常由适体结构域和表达平台域两部分组成[27]，适体结构域与配体结合后通过构象的改变调控下游基因的表达[28]。根据作用机制可将c-di-GMP的核糖开关分为c-di-GMPⅠ型和c-di-GMPⅡ型[29，30]。c-di-GMP Ⅰ型核糖开关与c-di-GMP结合后，可改变表达平台域的构象，抑制mRNA，从而调控下游基因的表达[29]。c-di-GMPⅡ型核糖开关基于其表达平台域具有核酶活性，与c-di-GMP结合后能催化自我剪切mRNA，形成外显子，暴露核糖结合位点，进而促进蛋白质合成[30]。如在艰难梭菌中，c-di-GMP与被称为 Cdi2_4的c-di-GMPⅡ型核糖开关特异性结合可调控Ⅳ型鞭毛（T4P）基因表达，从而促进艰难梭菌的聚集[31]。

二、c-di-gmp在细菌生物膜形成中的调控作用

1.生物膜的形成

生物膜是指细菌黏附于生物或非生物接触表面，分泌胞外基质并将其自身包绕其中而形成的大量细菌膜状聚集物[32]。胞外基质是生物膜的主要支架，占到生物膜总体积的85%，可促进生物膜内细胞之间的交流。胞外基质主要包括胞外多糖、蛋白质、核酸、脂类及细胞残骸等，其中，胞外多糖又是胞外基质的主要成分[33]。生物膜的形成依赖于一系列的细胞因子及信号通路的调控，其形成过程可为三个阶段：第一个阶段是细菌的可逆性、不可逆性黏附；第二个阶段是生物膜的形成；第三个阶段是生物膜的成熟及分散。

2.c-di-GMP对细菌黏附的影响

细菌最初和表面接触时，为克服表面的张力通过鞭毛介导的泳动（swimming motility）使细菌到达物体的表面。FleQ是鞭毛合成的主导调节因子，它与flhA结合可启动鞭毛基因的级联表达[34]。FleQ的活性不但与 FLeN有关[34，35]，也受 c-di-GMP的调控[26]。目前已证实，FLeN与c-di-GMP均可通过抑制ATP酶的活性调整FleQ的功能，使FleQ不能调控下游鞭毛基因，进而抑制鞭毛的合成[36]。YcgR作为c-di-GMP的受体，其包含PliZ结构域，当c-di-GMP与YcgR结合时也可抑制鞭毛的合成[37]。c-di-GMP对细菌鞭毛的抑制发生在细菌的可逆性黏附之前可阻止生物膜的早期形成，发生在可逆性黏附之后可消除表面动力使细菌稳定的黏附于接触表面促使可逆性黏膜向不可逆性黏附转变。

细菌的不可逆性黏附与细菌群集运动（swarming motility）、颤动（twitching motility）及胞外多糖密切相关。目前已证实DGCs及PDEs影响细菌的群集运动，研究发现SadC是一种DGC，BifA是一种PDE，它们可通过调节c-di-GMP的水平进而调控细菌的表面运动及不可逆性黏附。如在铜绿假单胞菌中sadC突变型菌株可促进细菌的群集运动，抑制细菌的不可逆性黏附；bifA突变型菌株则与此相反，即其可促进细菌的不可逆性黏附，抑制细菌的群集运动；而只有bifA型突变菌株对细菌的颤动起抑制作用[38，39]。Pel与Psl为铜绿假单胞菌的两种胞外多糖，Colvin等人发现铜绿假单胞菌pel型突变菌株和psl型突变菌株其生物膜发育的单细胞阶段是受抑制的，并且与非突变型菌株相比突变型菌株形成的生物膜量也有所减少[40]。

3.c-di-GMP与生物膜的成熟

细菌的黏附于表面后增殖形成微菌落，然后聚集成大菌落，最后形成成熟的生物膜。

而胞外多糖在细菌的黏附及生物膜的成熟阶段都发挥的重要的作用。胞外多糖具有多样性，比如铜绿假单胞菌能产生三种不同的胞外多糖即alginate，Pela和Psl。alginate由铜绿假单胞菌的黏液性菌株产生，c-di-GMP可调控alginate的合成。含PilZ结构域的Alg44是c-di-GMP的受体蛋白，其在体外与c-di-GMP结合可以调节alginate的合成及聚合，当细胞内c-di-GMP呈高浓度表达时，alginate的合成也相应有所增加[41，42]。Psl与Pel不仅参与细菌的黏附，也与生物膜的成熟有关[40]。在生物膜的成熟过程的早期，Pel作为微生物群落形成生物膜的结构支架，并且与生物膜的致密性有关[43]。FleQ作为c-di-GMP的受体也参与调节胞外多糖Pel的基因转录。研究发现，与其他的细菌转录因子所不同的是FleQ即可抑制pel的转录又可激活pel的转录。比如当FleN及c-di-GMP不存在时，FleQ可与pel的启动子结合从而抑制pel的转录。但当FleQ与c-di-GMP或者FleN结合后，FleQ对pel的抑制作用也被解除，同时激活pel的转录[44，45]c-di-GMP与Pls之间是一种正反馈调节的关系，即当具有DGCs活性的蛋白刺激c-di-GMP的合成时，c-di-GMP又可促进Pls的合成，而合成的Pls反过来又作用于c-di-GMP。Irie等人发现，Pls可以通过调节两种DGCs（SiaD和SadC）促使胞内c-di-GMP呈高浓度表达，高浓度的c-di-GMP又可促进Pls及其他生物膜成分的产生[46]。

目前对微菌落演变为大菌落的机制知之甚少，可能是随着时间的推移，微菌落继续发展成为大菌落。另外生物膜的成熟或许也与基因组的调控有关，但不可否认的是胞外多糖在生物膜的成熟阶段发挥着重要作用。Luyan M等人研究发现，在细菌的黏附阶段，Pls分布在细菌的表面以促进细胞间的相互作用及胞外基质的形成，利于细菌在表面形成生物膜；在生物膜的成熟阶段，Pls的分布具有差异性，即Pls主要积聚在生物膜的周围，而中心区的Pls较少甚至没有。但当生物膜分解时，浮游的细菌则会分布在Pls较少的中心区，这也表明Pls为细菌的再黏附提供了一定的条件[47]。

由生物膜引起的感染普遍存在，如：肺囊性纤维化、隐形眼镜相关角膜炎、龋病、种植体周围炎等。常规的抗生素药物治疗很难彻底清除生物膜，并且容易诱发细菌的耐药性。研究发现生物膜中细菌的细胞耐药性是浮游细菌细胞耐药性的1000倍，这也与生物膜的胞外基质或者eDNA有关[48]。在生物膜中大量的胞外基质将细菌包绕，形成的狭窄空间使药物难以穿透生物膜；并且生物膜中的细菌可通过群体感应系统感知环境变化，产生自体诱导因子传递信号，分泌毒力因子和细胞外基质等对抗环境作用，实现菌种内及菌种间的相互作用和协调，这些机制增加了生物膜对环境机制的抵抗性。c-di-GMP是细菌内广泛存在的第二信使，目前我们已经知道在一些细菌体内c-di-GMP对生物膜的调控与其浓度有关，也已经证实许多调节c-di-GMP代谢的酶参与细菌黏附作用及生物膜的成熟。那么是否能通过调控细菌体内c-di-GMP的水平或者相关的代谢酶来破坏细菌生物膜，从根本上治疗由细菌生物所引起的疾病还有待于进一步研究。