骨形态发生蛋白2基因治疗骨缺损中载体的研究进展

刘称称 刘 红 陈天杰 秦 爽 路政宽 黄 山 陈 良

作者单位：130021长春，吉林大学口腔医院·吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室（刘红为通讯作者）

牙周炎伴随的牙槽骨吸收、拔牙后剩余牙槽嵴萎缩、腭裂、手术治疗等原因引起的颌骨骨量丢失是口腔医学领域最常见的临床表现之一。目前对骨缺损修复的方法主要有以下几种：骨或骨替代物移植，化学药物，牵张成骨，干细胞组织工程等[1，2]。有限的自体骨来源、手术时造成的二次伤害等原因限制了其临床应用；同种异体骨制备及保存复杂，尤其是其本身的免疫原性及移植后的各种并发症也严重影响了其应用。应用化学药物不仅所达到的骨吸收抑制作用有限，而且因口服或静脉等全身给药方式，导致药物的有效治疗浓度维持时间短，需要频繁大量服药，而长期应用又对胃肠道、肾脏和牙槽骨等造成不同程度的损伤。使用胚胎干细胞尚存在伦理问题，成体干细胞需通过手术获取，安全性不足、费用昂贵及操作复杂等原因尚未被社会和广大患者所接受[3]。骨形态发生蛋白2（BMP-2）是骨缺损修复领域里研究最多最深入、效果最确切的成骨生长因子[4]。但是单纯应用BMP蛋白半衰期较短，用量大，而且来源困难。随着分子生物学和细胞生物学理论与实验技术的进步，应用转基因技术治疗骨破坏正成为国际上研究的热点。基因治疗通过将成骨基因导入细胞，不同于重组细胞因子的爆发性释放，可实现高活性成骨蛋白的持久表达及释放[5]。而基因进入细胞需要载体的协助，本文就对BMP-2基因治疗骨缺损中载体的研究进行阐述。

一、病毒类载体

病毒类载体是目前应用BMP-2基因治疗中主要的载体，主要包括慢病毒、腺病毒和腺相关病毒等。

1.慢病毒载体

慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分[6]。其以转染效率高、可持续稳定表达外源基因、增加调控基因后可调控目的蛋白的表达量、容纳大片段（8～10kb）的外源性目的基因和安全性高等优点，近年来已经越来越多的应用于骨缺损修复和再生领域并取得了很好的效果[7]。孙健等[8]的实验证实携带BMP-2基因的慢病毒载体感染大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）后，BMP-2通路增强了细胞的黏附能力及相关成骨分化因子骨桥蛋白（OPN）、骨钙素（OCN）、胶原蛋白Ⅰ（Col1）的表达量，可明显促进大鼠BMSCs向成骨细胞定向分化。张镇等[7]通过慢病毒载体成功将BMP-2基因转入第3代人脐带间充质干细胞，体外实验碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色强阳性证实了诱导成骨活性。Guan等[9]的实验发现携带BMP-2基因的慢病毒载体感染人尿源性干细胞（USCs）后，USCs高表达BMP-2基因，并且成骨转录因子-2（Runx2）和OCN也高表达，组织学研究发现这一体系可以促进新骨的形成。Lin等[10]以慢病毒（LV）为载体，将BMP-2基因以及绿色荧光蛋白（GFP），即LV-BMP/GFP体系转入体外培养的人BMSCs内，此为实验组，该实验的对照组为LV-GFP，PCR检测表明实验组的成骨标记因子高表达于对照组，联合免疫缺陷鼠体内实验发现，实验组较对照组有更多的新生骨生成。综上所述：慢病毒可以作为BMP-2基因治疗中一种有效的载体。

2.腺病毒载体

腺病毒（AD）是一种无包膜、具有57种血清型的线性双链DNA病毒，在目前已知的病毒载体中，腺病毒载体是最有效的基因传递系统，其装载基因容量大，可达37kb；宿主细胞广泛；滴度高，短期内转染效率高，并且我们已经掌握其最安全的剂量[11]。Johannes等[12]通过AD成功将BMP-2基因转入人间充质干细胞（MSCs）中，实验证实MSCs表达的BMP-2、OPN、OCN、Runx2量明显增高。何春耒等[13]发现携带BMP-2的重组腺病毒载体能够高效转染培养的兔BMSCs，使得BMSCs能够高效、持续表达、分泌BMP-2蛋白。另外有实验表明：在高糖环境下，AD介导的BMP-2可以成功转染大鼠BMSCs，转染后靶细胞可存活，目的基因正常表达，表达量较对照组明显增加，从而为糖尿病患者骨折难愈合、不愈合在基因治疗方面寻找到突破口[14]。Menendez等[15]构建马的骨、软骨缺损模型，然后将Ad-BMP-2体系直接注射到缺损部位，实验发现其能促进骨、软骨的生成，但是作用时间比较短，无法提供长期的骨软骨修复。Wang等[16]以转染了Ad-GFP-hBMP-2的兔BMSCs为实验组，以未转染组为对照组，研究发现：在每一个相同的时间点，实验组的ALP活性均较对照组的高，BMP-2基因及表达量也呈现出相同的趋势，体内实验发现：实验组的骨生成量明显较对照组多。Zhang等[17]将hBMP-2与hVEGF-165双基因共表达腺病毒载体转染兔BMSCs，结果发现转染后的BMSCs高表达BMP-2基因，并且成骨诱导21天后茜素红染色可证实有明显的钙结节的形成。由此可以推论：AD是BMP-2基因治疗中有效的载体

3.腺病毒相关病毒载体

腺病毒相关病毒（AAV）是一类单链线状DNA缺陷型病毒，其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。和Ad相比，AAV能够减小致病性、降低抗原性[18]。柯金等[19]实验发现携带BMP-2的AAV-2载体转染兔BMSCs后ALP活性，钙离子含量以及成骨基因的表达均显著上调；同时，植人转hBMP-2基因的兔BMSCs，实验组介导了全厚头骨骨缺损的修复，由此我们可以得出结论：AAV携带BMP-2基因转染可显著增强兔BMSCs的成骨能力。Dupont等[20]以AAV为载体，将BMP-2基因植入人BMSCs内，实验发现此举能显著提高BMSCs的BMP-2蛋白表达量以及ALP活性，并且通过构建动物模型也得出了相同的结论。王敏等[21]构建大鼠牙槽骨缺损模型，实验组骨缺损区植入浸有携目的基因hBMP-2和标记GFP的重组腺相关病毒液（rAAV-hBMP2-GFP）的明胶海绵块，对照组植入只浸有携GFP的空病毒液（rAAV-GFP）的明胶海绵块，结果表明：两组样本牙槽骨缺损处的骨密度值均随时间的增加而增高，但是在相同的时间点，实验组样本牙槽骨缺损处骨密度值均高于对照组，这说明AAV载体可以介导BMP-2基因成功修复大鼠牙槽骨缺损。

病毒载体由于其较高的转染效率是目前应用最多的基因载体，但是作为一种改造的病毒，其价格昂贵，难以大规模生产，且存在安全隐患和免疫原性等问题，因此许多学者把注意力逐步转向对非病毒载体的研究。非病毒载体主要包括脂质体和阳离子聚合物等[22]。

二、非病毒类载体

1.脂质体

脂质体是一种人工合成的脂质双分子层球形囊泡，在1964年首次被Bangham和Horne报导[23]。其是目前最常用的非病毒类载体，它是将DNA包裹在类脂质双分子层内而形成的微型包裹体转运进入靶细胞，质粒DNA与阳离子脂质体结合后能够将其电荷转变为正电性，从而易于与带负电荷的细胞膜结合，以增强基因的转染效率，而且由于脂质双层的包裹，被包封的DNA得到保护，不易被核酸酶降解[24]。赵铭等[25]利用脂质体Lipofectamine TM2000介导hBMP-2基因转染第4代脂肪干细胞（ADSCs），术后检测发现血清钙、磷及ALP水平明显升高，X线检查可看到有明显的成骨、骨缺损得到修复，HE染色可见到大量的成骨细胞生成。俞莉敏等[26]以BMP-2为目的基因，人BMSCs为载体细胞，以非病毒载体脂质体质粒介导转染人BMSCs，建立可稳定表达BMP-2的有限种子细胞系。结果表明：BMP-2基因转染修饰的人BMSCs生长增殖分化等生物学活性良好，可稳定表达分泌外源转染BMP-2基因，并且实验组的ALP活性显著高于对照组。唐宇欣等[27]使用脂质体将BMP-2基因转染取自同一只SD大鼠的BMSCs和ADSCs中，实验发现：BMSCs和ADSCs组的BMP-2基因表达均升高，并且Runx2、Col1、ALP等成骨基因的表达均上调，茜素红染色结果显示：钙结节量明显增多。这说明脂质体是BMP-2基因治疗中一种可靠的载体。

2.阳离子聚合物

阳离子聚合物也具有良好的DNA结合和保护能力，同时还具有良好的生物相容性、低毒性及易于化学修饰以改进其靶向性等优点，成为基因载体研究中的新方向。目前作为基因载体常用的阳离子聚合物包括：聚赖氨酸（poly-L-lysine，PLL），聚乙烯亚胺（PEI），聚丙烯亚胺树状物（polypropylenimine，PPI）， 聚 酰 胺 - 胺 型 树 状 物（polyamidoamine，PAMAM），壳聚糖等，其中PEI是目前最有效也是研究最多的非病毒基因载体。下面主要对PEI在BMP-2基因治疗中的作用进行阐述。Lü等[28]利用PEI衍生物GenEscortTMII为载体，介导BMP-2基因转染犬BMSCs，体外研究发现转染组的ALP活性、BMP-2基因、Runx-2、OPN基因表达量较非转染组明显增高，并且裸鼠动物实验发现较对照组相比，实验组有更多的新生骨量。由于PEI带有大量正电荷，使其具有较高的细胞毒性，所以Jin等[29]利用带有负电的海藻酸盐与PEI通过静电力相互作用形成复合物PEI-al，中和PEI过多的正电荷，从而降低其毒性，MC3T3-E1细胞转染PEI-al/pBMP-2复合物后主要的成骨标记物Col1、丝氨酸蛋白酶7（SP7）、Runx2、ALP的表达均有不同程度的上调，说明BMP-2的表达能够促进MC3T3-E1向成熟的成骨细胞分化；茜素红染色的结果也表明转染BMP-2基因后MC3T3-E1细胞分泌和促骨基质矿化的能力也明显提高了，并且将基因修饰的细胞植入大鼠的颅骨缺损后发现PEI-al/pBMP-2复合物具有一定促进大鼠颅盖骨缺损修复的作用。综上：PEI是BMP-2基因治疗中一种可靠的载体。

非病毒类载体具有低毒、低免疫反应、可反复应用等优点，但也有靶向性差、难通过细胞屏障、基因转染效率低、不能长期表达及表达不稳定等缺点。由于以上转染方法存在的缺点，人们一直在寻找一种更加有效的转染技术，即物理方法类转染技术。其主要包括基因枪法、电穿孔法以及超声法。

三、物理方法类载体

1.基因枪法

1987年，Sanford，Klein等人首创一套火药驱动的基因导入设备，一次可以将目的基因导入数以千计的细胞[30]。最初他们使用该设备直接将包裹在钨粒表面的外源RNA或DNA导入大蒜表皮获得了瞬时表达，这标志着基因枪原理上的成功。基因枪技术，又被称为生物弹道技术或微粒轰击技术，其基本原理就是将外源基因包裹到比重大而化学性质很稳定的微米级的金或钨上，然后用微粒加速装置打入靶细胞或组织。Li等[31]构建新西兰大白兔桡骨缺损模型，新鲜骨缺损于截骨后立即使用基因枪进行BMP-2基因局部转染，对照组截骨后自然愈合，实验观察：治疗组骨痂形成数量普遍多于对照组，Lane-sandhu X线评分和骨结合率治疗组优于对照组，并且通过Western-blot和RT-PCR检测证实治疗组骨缺损周围的BMP-2含量明显多于对照组。由此可以看出应用基因枪介导BMP-2基因局部转移治疗新鲜骨缺损效果明确。朱小萌等[32]也通过构建相同的动物模型证明了基因枪介导BMP-2治疗陈旧性骨缺损效果明确。

2.电穿孔法

物理法目前研究应用较多的为电穿孔法，电穿孔法系指使用高强度的电子场导致暂时性的细胞膜孔开放，由此促使外源性的DNA进入细胞内部。Kawai等[33]为了用非手术方法解决牙槽骨缺损这一难题，用电穿孔方法在大鼠上颌的第一磨牙牙周组织中导入了BMP-2基因，结果发现：在目标区域发现了外源BMP-2基因，基因导入5天后就观察到新生牙槽骨，7天后可观察到新生牙槽骨与原有骨组织发生骨连接。Ferreira等[34]通过电穿孔法将BMP-2基因转染兔BMSCs，RT-PCR检测转染细胞BMP-2 mRNA的表达量明显增高，Elisa检测发现：BMP-2蛋白表达量也呈现明显增高趋势，，并且转染组ALP活性也明显增强。这说明利用电穿孔法可以将BMP-2基因有效的转染BMSCs，且转染结果稳定。此法体外应用效果较好，但其所需的高强度电流对组织的明显损害，限制了其在活体组织的应用。

3.超声法

Sun等[35]采用超声微泡破裂法将含增强型GFP的重组BMP-2质粒进行小鼠后肢骨骼肌体内转染，同时设定相应对照组，观察其表达情况，而后进行荧光显微镜下计数、免疫组化检测。结果发现，质粒注射后7天，A组（单纯质粒组30μl）和B组（质粒+微泡+超声组30μl）两组在荧光显微镜下均观察到GFP表达，但B组阳性肌纤维百分率高于A组，提示超声介导微泡法能提高基因转染率。14天后，免疫组化结果分析显示BMP-2表达量D组（质粒+微泡+超声组100μl）多于C组（单纯质粒组100μl）表达量，同样证明超声介导微泡破裂法能增加外源性基因转化率和表达水平。

以上对BMP-2基因治疗骨缺损中载体的研究进行了阐述，每种载体都有其优点和缺点，相信随着研究深入以及载体改性技术的发展，性能更加优异的载体会在骨修复的基因治疗领域发挥更好的作用，这样基因治疗骨缺损才能产生令医患双方都满意的治疗结果，相信在不久的将来，基因治疗将会成为骨科疾病治疗方法中最为有效和经济的治疗手段之一。