昆虫杆状病毒表达系统在动物疫苗研究的应用

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(黑龙江省兽医科学研究所, 黑龙江 齐齐哈尔 161005)

0 引言

杆状病毒表达系统自建立以来广泛应用于生物检测、疫苗生产、基因治疗等方面。昆虫细胞-重组杆状病毒系统提供了一种蛋白质生产系统，生产可溶形式的重组蛋白，并能高效表达。表达的蛋白质具有大多数的翻译后修饰的功能，因此产生的膜蛋白具有正确的折叠构象，这是该方法优于原核表达系统的主要特点[1]。昆虫杆状病毒表达系统主要是针对杆状病毒构建载体，与哺乳动物细胞表达系统相比大大缩短了从基因克隆到蛋白表达的时间。杆状病毒基因组较大，能够克隆大的DNA片段，从而能够表达复杂的蛋白质聚集体。杆状病毒不能感染非昆虫来源的细胞，因此表达系统表达的重组蛋白对人和动物无害。

1 杆状病毒表达系统生物学

杆状病毒(Baculovirus)因病毒呈杆状而得名，是一种有囊膜包裹的闭合环状双链DNA病毒。杆状病毒主要包括核多角体病毒属和颗粒体病毒属，其中核多角体应用较广泛[2]。目前报道杆状病毒能够感染600多种昆虫细胞，无脊椎动物的细胞是其宿主细胞。在Genbank上，可以检索到多条完整的杆状病毒基因组序列，虽然不同种类杆状病毒基因组差别很大，但有近30个参与DNA复制、表达、病毒入侵及装配等基因编码有关的核心基因，在所有杆状病毒的基因组中高度保守。此外，调节宿主基因表达的蛋白编码区的基因序列也相对保守。杆状病毒在基因表达的极晚期，为了抵御虫体之间横向传播时外界环境的不利因素，分别受到超强polh启动子大量合成多角体蛋白(polh)，多角体蛋白形成包裹体基质。p10启动子调控大量合成P10蛋白，p10蛋白参与包裹体从细胞核中的释放。杆状病毒表达系统的基础是外源基因插入杆状病毒超强polh启动子和p10启动子之后，通过这两种启动子来大量表达外源蛋白。缺失这两种蛋白，杆状病毒在培养的细胞间和昆虫体内进行传播不受影响[3]。

2 杆状病毒表达系统的特点

杆状病毒表达系统对翻译后进行加工修饰蛋白机制完善，使表达蛋白形成三级或四级复杂结构，进而使外源蛋白尽可能有天然蛋白的结构，具有很高的蛋白活性，免疫原性可媲美天然蛋白[4]。杆状病毒表大系统启动子能够高效的驱动靶基因高效表达，目的蛋白表达量可达到细胞总蛋白的50%左右。杆状病毒全基因组较大分子量(90～180kb)，具有多个天然强启动子，可以插入DNA(约10kb)较大片断的外源基因；并能够多基因同时表达，实现同时容纳多个外源基因。多个基因共表达，可以克服成分单一的亚单位疫苗免疫原性弱的缺点，病毒样颗粒还可以发挥佐剂的作用。

杆状病毒不能感染哺乳动物，对人类没有致病性，应用没有安全顾虑；使用的昆虫细胞Sf21，Sf9或High five可在无二氧化碳条件下27℃进行贴壁或悬浮培养，操作相对简单，工业化生产方面具有天然优势。

3 杆状病毒表达系统在动物疾病研究中的应用

2006年勃林格殷格翰公司首次推出猪圆环2型病毒载体灭活疫苗，于2010年获农业部批准引入，成为国内第一个针对猪圆环病毒感染的疫苗。疫苗保护力好1针1 mL 2周龄起保护至出栏。在禽流感疫苗研究方面，Rezaei等将重组有禽流感病毒H1N1、H3N2HAs和M1基因的杆状病毒共同转染昆虫细胞，免疫小鼠后攻毒，与对照相比，免疫小鼠并未出现死亡等其他反应[5]。昆虫杆状病毒表达系统针对细菌感染的亚单位疫苗的报道较少，仅见到有使用杆状病毒载体系统表达布鲁氏杆菌热激蛋白的报道。寄生虫疫苗研究方面，杆状病毒昆虫表达系统细粒棘球蚴Eg95抗原，具有良好的免疫原性，为优化细粒棘球蚴疫苗提供了热点候选分子之一[6]。目前，杆状病毒载体系统主要应用于动物病毒疫苗的研究，包括口蹄疫病毒、羊痘病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒等相关蛋白均在杆状病毒系统内表达，且被证实可以引起机体产生较高水平免疫应答，但大多数疫苗仅限于实验室研究。

4 结语

昆虫杆状病毒表达系统，不仅应用于亚单位疫苗的研发和生产，还应用于重组蛋白结构功能研究，作为免疫原制作单克隆抗体，进入某些哺乳动物细胞基因治疗、生物防治等领域。

郑瑾,任斐,余翔,等.利用昆虫-杆状病毒表达系统制备 HPV 16 E6 蛋白[J].西北大学学报,2008,38(5):775-778.

[2] 李晶梅,靖志强.昆虫杆状病毒表达系统生产流感疫苗的研究进展[J].中国兽药杂志,2012,46(12):67-70.

[3] 陈琳,吴小锋.昆虫杆状病毒粒子的蛋白质组成及生物学功能[J].蚕业科学,2014,40 (3):533-543.

[4] 张民秀,谢芝勋,黄莉,等.H9N2亚型禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达[J].基因组学与应用生物学,2017,36(3):859-864.

[5] Bae JE & Toth TE. Cloning and kinet-ics of expression of Brucella abortus heat shock proteins by baculovirus recombinants[J].Veterinary Microbiol, 2000, 75:199-204.

[6] 周必英,陈雅棠,李文桂.细粒棘球绦虫 E995 基因工程疫苗研究进展[J].中国地方病学杂志,2008,27(6):709-711.