NF-κB P65 siRNA对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖及迁移的影响

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(山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000)

动脉粥样硬化性心血管疾病是糖尿病的主要并发症，同时也是糖尿病患者致死的主要原因。近年来，已有大量资料证实高血糖可抑制人脐静脉内皮细胞以及人主动脉内皮细胞的增殖、迁移以及血管的发生过程[1]，高血糖导致的血管内皮细胞功能紊乱是糖尿病患者血管病变的主要原因。

血管内皮细胞是存在于血管内皮表面高度分化的单层细胞，是构成血管的重要组成部分，血管内皮细胞的迁移是冠状动脉侧支形成的重要步骤。NF-κB作为重要的转录因子之一，对多种促炎症细胞因子、黏附分子、趋化因子等的表达起着重要调控作用[2]，在动脉粥样硬化形成过程中，以血管壁的炎症为主要特征，而NF-κB参与炎症过程中的多种信号传导途径，并且在动脉粥样硬化晚期参与平滑肌细胞增殖的生长因子亦有NF-κB调控，因而认为NF-κB的激活是动脉粥样硬化发生发展的始动机制之一。本研究采用高糖诱导人脐静脉内皮细胞，构建内皮细胞损伤模型，利用RNA干扰技术靶向沉默NF-κB P65，抑制血管内皮细胞内NF-κB P65信号通路，通过检测各组细胞增殖及迁移能力，以期阐明阻断NF-κB信号通路对高糖诱导的脐静脉内皮细胞的增殖及迁移的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 Lipofectamine 2000、RPMI 1640培养基购自美国Invitrogen公司，兔抗人NF-κB P65购自美国Cell Signaling Technology公司，辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG购自美国Abcam公司，RIPA裂解液购自碧云天生物技术研究所。

1.2方法

1.2.1人脐静脉内皮细胞的原代培养 取正常足月新生儿脐带20 cm，将无菌平头针头插入脐静脉一端，通过针头注入PBS清洗2～3遍，脐带另一端用无菌手术先结扎，通过针头将胰蛋白酶注入脐静脉内，消化时间为10 min左右，消化完毕继续注入PBS冲洗，将冲洗液收集至离心管，置于离心机，以1000 r/min离心10 min，弃上清，用含20%胎牛血清的1640培养基重悬细胞，转移至培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中，24 h后更换培养液，待细胞爬满培养瓶底进行传代。

1.2.2细胞转染 将细胞按照1.5×105的浓度接种于6孔板，培养24 h后，待细胞融合度达到70%时按照说明书进行转染。将si-RNA与Lipofectamine 2000按1∶50比例混合，以si-RNA终浓度40 pmol/L进行转染。细胞转染48 h后，裂解细胞提取蛋白，采用Western blot检测转染后细胞内的NF-κB的表达水平，进行敲除效率鉴定。

1.2.3实验分组[3]随机分为三组：(1)高糖培养组，加入33.3 mmol/L D-葡萄糖继续培养；(2)si-control组，加入33.3 mmol/L D-葡萄糖的同时加入si-control进行对照转染；(3)si-NF-κB组，加入33.3 mmol/L D-葡萄糖的同时加入si-NF-κB进行阳性转染。

1.2.4NF-κB P65的敲除鉴定 Western blot检测不同处理组细胞NF-κB蛋白的表达。转染后继续培养细胞48 h后弃去培养液，4℃预冷的PBS洗涤细胞3次，加入细胞裂解液后置于冰上裂解细胞30 min，将裂解后的细胞碎片和裂解液转移至1.5 ml离心管中，于4℃，12000 r/min离心5 min，取上清液，BCA法进行蛋白浓度测定，调整蛋白浓度后置于沸水中5 min使蛋白变性，上样后于电压40 V进行电泳，电泳完成后将蛋白质转移至硝酸纤维素薄膜。先后加入稀释好的兔抗人NF-κB p65(1∶500)、山羊抗兔IgG(1∶2000)，化学发光成像系统曝光蛋白条带，采用Image J软件对蛋白条带进行灰度值测量分析。

1.2.5细胞增殖检测[4]采用实时无标记动态细胞分析技术实时监测细胞的增殖。将转染后的细胞用胰蛋白酶消化，调整细胞悬液浓度，将细胞浓度调整到50000个/100μL，加入E-Plate检测板中，将加入细胞悬液的E-Plate检测板放入培养箱中的检测台上，进行实时动态的细胞增殖监测，连续监测3 d，从而获得细胞增殖曲线。

1.2.6细胞迁移率检测 细胞消化、计数、铺板步骤同前，待细胞在6孔板融合度达到70%时，用无菌枪头在孔的底部快速垂直划线。划线后分别在培养6、24、48 h后显微镜下在划痕同一部位拍照，ImageJ软件测量划痕区的面积，进行统计分析。

2 结果

2.1NF-κB P65的敲除效率 与其他两组比较，si-NF-κB组可明显下调细胞内NF-κB蛋白的表达(P<0.05)，而高糖培养组与si-control组相比差异无统计学意义。见图1。

2.2干扰NF-κB表达对细胞增殖能力的影响 结果显示(见图2)：si-NF-κB组细胞增殖较高糖培养组明显加快，表明敲除NF-κB可逆转高糖对HUVECs增殖的抑制作用。

2.3干扰NF-κB表达对细胞迁移能力的影响 结果表明(见图3)：细胞划痕后6 h，si-NF-κB组与高糖培养组相比，细胞迁移率无明显差异。细胞划痕后24、48 h，均可见si-NF-κB组细胞迁移率明显高于高糖培养组(P<0.05)，表明沉默NF-κB后细胞的迁移能力提高。

图1 siRNA转染HUVECs细胞后检测NF-κB蛋白的表达水平

图2 干扰NF-κB对细胞增殖能力的影响

图3 干扰NF-κB对细胞迁移能力的影响

3 讨论

糖尿病血管内皮细胞的损伤是糖尿病发生血管病变的前提，在动脉粥样硬化的发生发展过程中起重要作用。现已明确高血糖及多种细胞因子对血管内皮细胞具有毒性作用，但高浓度葡萄糖通过何种机制损伤内皮细胞、导致内皮功能障碍尚未明确[5]。已有研究发现，在动脉粥样硬化区和纤维化斑块区均存在激活的NF-κB，并检测到相关靶基因的表达，而未发生动脉粥样硬化的血管则很少或检测不到NF-κB的表达。提示NF-κB在动脉粥样硬化发生发展过程中具有重要的作用，动脉粥样硬化可能是NF-κB介导的慢性炎症过程。NF-κB调控参与动脉粥样硬化发生的多种基因表达，在细胞因子中已知肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素IL-1β均为其有效激活物。由此推测，高血糖及相关细胞因子可能是通过NF-κB的调控作用导致血管内皮细胞损伤，进而导致糖尿病大血管病变的发生[5]。

内皮细胞增殖及迁移功能在血管新生、内皮细胞损伤的愈合过程中起着重要作用。因此，在部分心血管疾病中，特别是在动脉粥样硬化发生的某些阶段中，内皮细胞增殖及迁移功能都扮演着重要角色。了解内皮细胞增殖及迁移的相关影响因素，对于掌握内皮细胞在心血管疾病中的作用有着至关重要的意义。

本研究结果显示，沉默高糖诱导的脐静脉内皮细胞中的NF-κB可以有效逆转高糖对细胞增殖及迁移的抑制作用。提示NF-κB在高糖损伤的血管内皮细胞中，可能是通过抑制受损细胞的新生及重建加速了动脉粥样硬化的发生发展。因此，通过阻断NF-κB信号通路，加强受损内皮细胞的新生及重建功能，从而控制糖尿病血管并发症，特别是动脉粥样硬化的发生发展具有重要意义。