秘鲁鱿鱼骨粉添加对酱油制曲的影响

詹超群，邓尚贵，霍健聪，修策，金凯楠

(浙江海洋大学 食品与医药学院，浙江 舟山，316000)

目前我国对鱿鱼加工副产物的研究利用已取得丰硕成果，如鱿鱼皮制取胶原蛋白、内脏用于生产活性蛋白肽、鱿鱼眼提取透明质酸等[1-2]，但唯独对鱿鱼骨的加工利用到目前为止基本处于一片空白。

制曲是酿造高品质酱油的关键，曲以大豆为主要培养基原料，含有多种微生物及生物酶，通过降解培养基中的各种蛋白质、碳水化合物，进而缔造氨基酸、肽和葡萄糖等多种酱油风味前体物质[3-5]。目前研究多集中于菌种复配对酱油制曲及风味的影响，及制曲工艺条件研究，而对酱油曲成分对酱油制曲风味影响的研究成果寥寥无几。

鱿鱼骨是当前鱿鱼加工产业中尚未得到充分利用的一类加工副产物。前期研究发现：鱿鱼骨中含有大量蛋白质和丰富的呈味氨基酸，是一类极具开发潜力的蛋白质资源。基于这一状况，本研究以鱿鱼骨为研究对象，将其添加到制曲原料中，探讨其对酱油曲风味的影响。本研究不仅有望为海鲜酱油的酿造提供一种风味优良的种曲，而且符合当前水产品加工副产物高质化利用方向。

1 材料与方法

1.1 材料

鱿鱼骨粉，鱿鱼骨由浙江兴业集团有限公司提供，为秘鲁鱿鱼骨，晒干后(水分含量5.24%)采用粉碎机粉碎至120目筛；酱油种曲购自上海佳民酿造食品有限公司，为蛋白酶和淀粉酶活性较高的中科3.951(即沪酿3.042)米曲霉孢子；鲁氏酵母为实验室自备(提前配制成108个/mL的菌悬液)；其余原料如大豆、面粉等均为市售。

试验用甲醛、盐酸、福林试剂，国药集团上海化学试剂有限公司，分析纯；乙腈，国药集团上海化学试剂有限公司，色谱纯。

1.2 主要设备及型号

紫外分光光度计(U-2800)，日本回立公司；固相微萃取设备(SUPELCO，57330-U)，美国Supelco公司；萃取头(100 μm PDMS，聚二甲基硅氧烷)，上海洽姆仪器科技有限公司；气质联用设备(安捷伦7890B)，美国安捷伦公司；其余均为实验室常用设备。

1.3 试验方法

1.3.1 酱油曲制备

参考舟山裕大酿造有限公司酱油曲制备工艺：优质黄豆1 000 g，加入1.3倍的水，浸泡10 h,100 ℃蒸汽灭菌处理20 min，处理后的黄豆冷水冲淋至40 ℃后沥干，并拌入300 g面粉，搅拌均匀后加入1.95 g种曲(即原料质量的0.15%)和10 mL鲁氏酵母菌悬液，同时分别加入0.5%(A组)、1.3%(B组)和2.0%(C组)的鱿鱼骨粉(以不加入鱿鱼骨粉为对照)。酱油曲制备好后进行后期培养，33 ℃培养12 h，然后翻曲1次，24 h后再翻曲1次；而后培养温度降至28 ℃，继续培养36 h后制曲结束。

1.3.2 酱油曲酵母总数、孢子数量及质量评定

孢子及酵母菌数的测定分别参考SB/T 10315—1999和GB 4789.15—2010；同时观察不同时间酱油曲的外形色泽品质。

1.3.3 相关酶活力的测定

蛋白酶活力测定参照GB/T 23527—2009，即40 ℃下水解酪蛋白每分钟生成1 μg酪氨酸所需的酶量定义为1个蛋白酶活力单位；α-淀粉酶活力测定参照CHUTMANOP的方法，酶解条件为40 ℃、pH 7.2，以可溶性淀粉为底物、30 min液化10 mg可溶性淀粉所需的酶量为1个酶活力单位；糖化酶活力测定采用国标法GB/T 8276—2006，在40 ℃、pH 4.6条件下，1 h分解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖为1个酶活力单位。

1.3.4 固形物含量测定

固定物含量测定采用105 ℃烘箱法干燥至衡重，根据前后重量变化确定固形物含量。

1.3.5 挥发性风味物质鉴定

参考冯笑军[6]的方法，略有变动。具体操作为：称取10 g样品置于100 mL螺口瓶中，加入24 mL蒸馏水和8 g NaCl，聚四氟乙烯密封后于磁力搅拌器上60 ℃搅拌处理15 min，用DVB/CAR/PDMS(二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷)萃取头吸附60 min，而后插入气相色谱进样，解析5 min。色谱柱采用安捷伦毛细柱，升温速度2 ℃/min，到90 ℃后保温5 min；而后升温速度调至8 ℃/min，到250 ℃后保温1 min；载气为氦气，流量1.0 mL/min；质谱条件为电子能力80 eV，电压350 V，离子源温度240 ℃，四级杆温度150 ℃，质量扫描范围m/z50～450。测定完毕后进行定性定量鉴定，其中定量鉴定采用面积归一化法，定量鉴定参考风味物质数据库。

1.3.6 数据处理

用SPSS 13.0对数据进行分析。利用ANOVA方差分析软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 制曲过程中种曲孢子及酵母菌数量的变化

制曲过程中酵母综述和孢子数的变化如图1和图2所示。由图1可知，对照和各处理组在制曲的4～20 h阶段酵母总数均呈上升趋势，在20～36 h阶段酵母总数则呈下降趋势，对照组和各处理组在20 h时出现最大值；各处理组在制曲过程中均显著高于对照组(p<0.05，除4 h外)。孢子在酵母发酵后期产生，从图2可以看出，36 h时两组孢子数均达到8.5×108以上，在相同制曲时间下总体来看同对照组间除个别组外无显著性差异(p>0.05)。

图1 制曲过程中酵母总数变化Fig.1 The changes of the total number of yeast in koji-making图中不同小写字母标识处理间差异显著(p<0.05)，下同。

图2 制曲过程中孢子总数变化Fig.2 The changes of the spores in koji-making

2.2 制曲过程中发酵曲外形色泽变化

图3是制曲过程中不同发酵时间种曲的外观形态变化。

图3 制曲过程中不同发酵时间种曲外观形态变化(B组)Fig.3 Morphologicalchanges of soy sauce koji during different fermentation time (B group)

从图3可以看出，发酵16 h，酱油曲外观附着白灰色菌丝体，淡黄色孢子数量很少，外观仅能看出略微呈黄色，曲料松散，有独特的曲香味；到24 h时，曲料表面菌丝体明显增多，外观蓬松，外观呈较为明显的黄绿色，无不良气味；当发酵时间为36 h时，曲料外观成形度差，呈明显黄色，曲料蓬松，曲香味明显，同对照比香味明显不同。

2.3 制曲过程中主要酶系活力的变化

蛋白酶是酱油曲质量的重要评价指标[7]，制曲过程中米曲霉分泌的蛋白酶可以降解大豆蛋白，产生氨基酸、多肽等多种风味物质，为酱油的良好风味做出重要贡献。沪酿3.042米曲霉是一种发酵特性较好的曲霉，发酵过程中会产生酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。由图4可知，在制曲28～36 h间，各处理组同对照之间存在显著性差异(p<0.05)，表明添加鱿鱼骨粉对酱油曲酶活力有一定促进效应，但各添加剂量间酶活力效应不同，其中B和C组间无显著性差异(p>0.05)。

图4 发酵过程中蛋白酶活力变化Fig.4 Protease activity changes during fermentation

酱油中的单糖、双糖及简单多糖含量对于增加酱油的黏稠度、提高酱油的挂杯性以及为美拉德反应提供原料至关重要，决定单糖、双糖等碳水化合物含量的酶是淀粉酶(α-淀粉酶和糖化酶)[9-11]。从图5和图6可以看出，各处理组除24 h外，其余时间α-淀粉酶和糖化酶活力均高于对照组，表明添加适量鱿鱼骨粉对米曲霉产生淀粉酶的活力有促进作用。

图5 发酵过程中α-淀粉酶活力变化Fig.5 Changes of α-amylase activity during fermentatio

前期研究发现，鱿鱼骨蛋白质含量较高，含有较多的碳水化合物，尤其是氨基酸含量高达82.86 g/100g，明显高于海螵蛸，且鱿鱼骨的氨基酸评分最接近FAO/WHO氨基酸标准模式，蛋白质质量较高。鱿鱼骨中丰富的碳源和氮源可能是促进米曲霉生长，进而合成更多高活性淀粉酶的原因。

图6 发酵过程中糖化酶活力变化Fig.6 Changes of glucoamylase activity during fermentation

2.4 固形物含量

制曲是给微生物提供碳源、氮源等营养物质，促使微生物菌体数量大幅增殖的过程，随着微生物数量的增长，培养基中的营养物质被消耗后变成CO2和水散失，培养基质量减轻，因而固形物含量能在一定程度上作为衡量制曲的指标[8]。从图7可以看出，随着制曲时间的延长，对照组与实验组的固形物含量均呈上升趋势，其中添加了鱿鱼骨粉的实验组在相同时间下固形物含量均低于对照组，表明各实验组中的酵母生长繁殖消耗了大量营养物质，但不同实验组间存在差异，其中B和C组在培养至36 h时固定物含量基本相同(60.8%和60.1%)，无显著性差异。

图7 制曲过程中固形物含量的变化Fig.7 Changes of solids content during fermentation

2.5 酱油曲中挥发性风味物质分析

采用GC-MS对实验组和对照组成曲的挥发性香气成分进行检测，结果见表1。从挥发性成分种类上来看，对照组和实验组检出的挥发性成分基本相同(除C组含有少量甲基吡嗪外)，包括5种醇类、8种酯类、4种酸类、4种醛类、2种酚类及其他成分5种，表明添加鱿鱼骨对酱油曲挥发性香气物质的成分没有任何影响；从挥发性成分的含量上来看，对照组中除乙醇、乙酸、苯乙酸、庚醛和苯乙醛含量高于实验组外，其余成分含量均低于实验组。总体来看，B组的挥发性成分含量达到36.31%，高于对照组3.58%，也高于A组和C组，且不同实验组的挥发性成分含量也各不相同，同添加量并无相关性，其中原因有待进一步研究。

表1 挥发性风味物质成分的GC-MS分析结果

注：“—”表示未检出。

3 结论

添加适量鱿鱼骨粉对米曲霉生长和相关酶系分泌无显著性影响，其中实验组的酵母数量显著高于对照组，但孢子数仅略高于对照组；鱿鱼骨添加量为1.3%的酱油曲在培养36h时，曲料色泽发黄，香气明显，质量较好；添加鱿鱼骨对酱油曲料中微生物各种酶系的分泌有促进效果，其中蛋白酶和淀粉酶活性都显著高于对照组；添加鱿鱼骨对酱油曲料的挥发性香气成分种类没有影响，且大部分挥发性成分含量均有不同程度上升，其中B组的挥发性成分达到36.31%，显著高于对照组的32.73%，表明添加鱿鱼骨对于酱油曲的发酵和品质提升具有促进效果。

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