高分辨质谱—非信息依赖数据采集—后靶向筛查策略在不明原因食物中毒鉴定中的应用

张美娟

摘 要 基于超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱（UPLCQTOF MS/MS）技术，建立了高分辨质谱非信息依赖数据采集后靶向筛查策略（HRMSDIAPost targeted screening strategy），并成功应用于不明原因食物中毒患者呕吐物及粪便样本中的有毒化合物筛查鉴定。样品经溶剂提取与净化后，采用5 mmol/L甲酸铵水（A）和0.1 %甲酸乙腈（B）作为流动相，在反相色谱柱上进行梯度洗脱。采用MSE模式对样品进行质谱（ESI+）全信息采集，经UNIFI筛查软件进行谱峰识别、谱库检索等数据分析，初筛出疑似有毒化合物α茄碱，随后结合其化合物特征及体内代谢行为，采用后靶向筛查策略在两种样品中均鉴定出相关化合物（包括水解产物及代谢产物等），如α卡茄碱与其水解产物β卡茄碱、γ茄碱/卡茄碱以及共同代谢产物茄啶。采用单点校正法测得两种样品中α茄碱含量均约为0.1 mg/kg，采用峰面积归一化法得到两种样品中龙葵素类似物总量分别约为0.5 mg/kg与0.6 mg/kg。本研究建立的高分辨质谱快速筛查策略可为不明原因食物中毒的未知毒物快速筛查鉴定提供有效的技术手段。

关键词 后靶向筛查； 未知有毒化合物； 高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱； 生物医学样品； 龙葵素

1 引 言

近年来，我国食物中毒事件时有发生，严重危害着广大民众的身心健康[1，2]。按照致病因子计，常见食物中毒可分为微生物性（包括细菌、真菌和病毒等）、化学性、有毒动植物及不明原因中毒四类。 2015年我国食物中毒事件共发生169 起，中毒5926人、死亡121人； 其中化学性毒物中毒事件23起。中毒597人、死亡22人， 化学性毒物中毒死亡人数占全年毒物中毒死亡数的18.2%[2]。因此，发展快速高效的未知有毒化合物筛查鉴定技术与策略，有助于食物中毒相关的法医学鉴定以及临床快速诊断和救治。

色谱质谱技术是目前有毒有害化合物筛查鉴定以及定量分析的主要技术手段之一，在与气相色谱（GC）、液相色谱（LC）等快速分离技术联用时，以飞行时间质谱（Time of flightmass spectrometry，TOFMS）为代表的高分辨质谱，具有较高的质量分辨率及较快的扫描速度，使每个色谱峰均能采集到足够的数据点和化合物信息量，为快速样品筛查鉴定提供了有效的技术手段，目前已被成功应用于食品及生物样品中目标化合物分析及未知物筛查。例如，López等[3]运用UPLCQTOFMS/MS开发了11种水果蔬菜中的农药残留筛查方法，Ojanper等[4]运用LCQTOFMS/MS建立了尿液中药物的筛查方法。

质谱筛查鉴定技术包括信息依赖型数据采集模式与非信息依赖型数据采集模式（Data independent acquisition，DIA）等，其中DIA模式是指不需对样品中的化合物进行预选择，而是采集所有从色谱中分离出的化合物质谱信息[5]。基于QTOF MS/MS技术的MSE全信息串联质谱采集模式，仅需运行一次LCMS/MS分析，便可同时获得高质量精度的母离子及其碎片离子信息，从而极大地提高了筛查效率和准确度，目前成功应用于水样中的药物及其代谢产物、旧档案纸张中真菌毒素、废水中的有机污染物等未知化合物的筛查鉴定中 [6～8]。但是，低丰度含量或低质谱响应的化合物的信号在上述MSE模式中的贡献较低，常易产生漏判。因此，后靶向筛查策略（Posttarget screening method或postrun target screening）[9，10]便成为其很好的补充。该策略是指在采集DIA全信息之后，依据质荷比，从总离子流中手动靶向提取某种或某类化合物的色谱及质谱峰； 或经合适算法及参数设定后进行谱峰的自动识别与提取，再行通过谱库检索，筛选并锁定疑似化合物，在无化合物对照品参考确证时，亦称可疑性筛查（Suspect screening）[11]。

本研究采用高分辨质谱非信息依赖数据采集后靶向筛查策略（HRMSDIAPost targeted screening strategy），在有效提高疑似待测化合物筛查鉴定辨识度的同时，结合临床中毒症状和疑似化合物的体内代谢及转化性质等，通过手动靶向提取了疑似待测化合物及其相关化合物（如水解产物及代谢产物）的质谱信息，再经综合分析、对照参考品的质谱比对确证，成功应用于一起不明原因食物中毒案例的篩查鉴定。鉴定的龙葵素类有毒化合物，是一类常见于马铃薯植株及其块茎中的有毒糖苷生物碱。当马铃薯由于贮存不当而变绿或发芽时，会产生大量的龙葵素，当龙葵素的含量超过200 mg/kg时，人服用后则可能导致中毒甚至死亡[12]，已报道的人口服最低中毒剂量（TDLo）为2.8 mg/kg[13]。龙葵素主要引起溶血作用、抗胆碱酯酶抑制作用、消化道中毒症状和神经症状，毒物检测结果与中毒患者所出现临床症状相吻合，故推断本例食物中毒事件是由一系列龙葵素有毒生物碱引起的。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪ACQUITY UPLC、四极杆飞行时间串联质谱仪Xevo G2 QTOF MS/MS（美国Waters公司）； Dionex UltiMate 3000液相色谱仪、Q Exactive四极杆静电场轨道阱串联质谱仪QOrbitrap MS/MS（美国ThermoFisher公司）； RVC 233离心浓缩仪（德国Christ公司）； R200D电子天平（德国Sartorius公司）； Sigma 3k30型高速冷冻离心机（美国SigmaAldrich公司）； MilliQ A10型超纯水系统（美国Millipore公司）。

α茄碱（αSolanine，纯度99%，北京百灵威科技有限公司）； 亮氨酸脑啡肽乙酸盐水合物（Leucine Enkephalin acetate salt hydrate，美国SigmaAldrich公司）； 甲醇、乙腈（色谱纯，韩国Duksan公司）； 甲酸（分析纯，北京百灵威科技有限公司）； 甲酸铵（分析纯，美国Acros Organics公司）； 实验用水为MillQ系统制备的超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm）； 滤膜（上海安谱科学仪器有限公司）。endprint

样品来源： 3名中毒人员在外就餐后当晚便出现明显身体不适，随即入院就医，其中一名儿童死亡，另外两名成人患者表现为头晕、恶心、呕吐、腹泻等疑似食物中毒症状，中毒原因不明、待查。取其中一名患者的呕吐物及粪便进行毒物筛查分析。

2.2 实验条件

2.2.1 UPLCQTOF MS/MS条件 色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSS C18（150 mm × 2.1 mm，1.8 μm）； 柱温50℃； 流动相A为5 mmol/L甲酸铵溶液（pH 3），流动相B为含0.1%甲酸的乙腈。洗脱程序： 0～0.5 min，13% B； 0.5～10 min，13%～50% B； 10～10.75 min，50%～95% B； 10.75～12.25 min，95% B。流速为0.4 mL/min； 样品进样量为5 μL。

离子源温度： 150℃； 脱溶剂气温度： 400℃； 脱溶剂气流速： 800 L/h； 锥孔气流速： 20 L/h； 毛细管电压： 0.8 kV； 锥孔电压： 25 eV； 电离模式： ESI正离子模式； 扫描模式： 分辨率模式，一级质谱分辨率为10000 FWHM； 采集模式： MSE模式； 扫描范围： m/z 50～1000； 扫描时间： 0.1 s； 碰撞能量： 低碰撞能量为6 eV，高碰撞能量为10～40 eV； 校正液： 亮氨酸脑啡肽（m/z 556.2771）。

UNIFI软件参数设置： 高能量下响应阈值： 5，低能量下响应阈值： 250； 背景噪音过滤强度： 中； 保留时间最大偏差： 0.3 min； 精确质量偏差阈值： 10 ppm； 可识别的化合物加合峰形式包括+H、+Na、+K、+NH4峰。实时校正液亮氨酸脑啡肽控制值为m/z 556.2771。

2.2.2 LCQOrbitrap MS/MS条件 色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）； 柱温40℃； 流动相A为5 mmol/L甲酸铵0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈溶液； 洗脱程序： 0～0.5 min，1% B； 0.5～10 min，1%～90% B； 10～12 min，90% B。流速为0.25 mL/min； 进样量为5 μL。

离子源温度： 320℃； 毛细管电压： 3.5 kV； 辅助气温度： 320℃； 鞘气流速： 10 L/h； 辅助气流速： 30 L/h。采集模式： 平行反应监测（Parallel reaction monitoring，PRM）； 碰撞能量CE 45 eV； 采集范围为50～1000 Da； 电离模式： ESI正离子模式； 一级质谱分辨率为35000 FWHM。

2.3 实验步骤

2.3.1 样品前处理 呕吐物： 取已干燥的呕吐物样品10 g，加入50 mL水，振荡混匀，取4 mL于离心管中，14000 r/min高速离心10 min后取上清液， 过0.22 μm滤膜，离心浓缩至干，进样前加入200 μL 5%（V/V）甲醇复溶。

粪便： 取粪便样品2 g于离心管中，加入5 mL水，振荡混匀，14000 r/min高速离心10 min后取上清液，加入2 mL甲醇与10 mL乙腈，涡旋混匀，14000 r/min高速離心10 min后取上清液，离心浓缩至干，进样前加入200 μL 5%（V/V）甲醇复溶。

2.3.2 有毒化合物质谱数据库的建立 数据采集在UPLCQTOF MS上进行，使用MassLynx软件（ver.4.1，美国Waters公司），筛查则使用质谱定性分析处理软件UNIFI（ver.1.8，美国Waters公司），其中配置了商业化的法医毒物数据库，涵盖麻醉药品、精神药品、生物毒素（包括动植物毒素及微生物毒素）及兽药等1200余种常见法医毒物。在该商业化数据库的基础上，本课题组添加了有毒生物碱、海洋生物毒素、常见非法添加化合物（降压药、糖皮质激素）等300余种化合物。

2.3.3 未知有毒化合物的UPLCQTOF MS/MS筛查分析 对两种处理后的样品参考通用的UPLC全梯度洗脱条件进行分离分析[14]，同时在MSE模式下采集质谱全信息，将数据导入到UNIFI 1.8（美国Waters公司）中进行自动谱峰识别、谱库检索等数据分析，筛选出疑似候选化合物后手动提取其相关水解产物及代谢产物的谱峰。

2.3.4 LCQOrbitrap MS/MS数据采集 毒生物碱α茄碱参考品的1μg/mL 乙腈溶液，在LCQOrbitrap MS平行反应监测（Parallel reaction monitoring，PRM）模式下，将呕吐物及粪便提取样品中的疑似色谱峰与参考品的色谱保留时间及二级质谱谱图进行比较，并根据两者的色谱峰面积，按照单点校正法，对样品中化合物浓度进行半定量分析。

3 结果与讨论

3.1 样品前处理方法选择

有毒化合物种类繁多、理化性质差异较大，不明原因食物中毒筛查鉴定的难点及特点在于： 需要获得全面、准确、可靠的信息，且无遗漏、无丢失地快速提取、判定目标化合物。因此，在未知有毒化合物的筛查工作中，需要开发多组分、低损失、快速简单的前处理方法[15]。目前针对复杂生物基质样品，常见的前处理方法包括液液萃取（Liquidliquid extraction， LLE）、固相萃取（Solid phase extraction， SPE）以及QuEChERS（Quick， easy， cheap， effective， rugged， safe）等。其中，SPE对化合物的选择性较强，较适用于靶向化合物的筛查； QuEChERS则常用于食品[16]及环境基质样品[17]的前处理中，所需样品量较高，达到满意的回收率时往往需要优化提取条件，故存在遗漏疑似化合物的可能，在生物样品中的应用有限。本研究则采用操作简单、普适性高的LLE方法[18]，采用水、甲醇、乙腈等作提取溶剂，可在较宽的范围内保留极性和弱极性化合物，并获得较高的回收率； 另外，甲醇、乙腈可沉淀生物样本中的蛋白质等大分子，从而降低基质干扰，有利于后续的LCMS筛查分析。endprint

3.2 MSE数据采集

本研究首先采用MSE全信息串联质谱模式，在预设定的低碰撞能扫描和高碰撞能扫描之间快速切换，从而同时完成两个扫描功能的DIA数据采集。在低能量扫描下，易得到相关的分子离子峰及其加合峰信息，在高能量扫描中，得到相关碎片峰的信息，并通过母离子与其碎片离子具有相同色谱行为的特性，进行母子离子的关联归属，将所有保留时间和峰形相同的色谱峰的离子组合成一张质谱图，其中包含了丰富的化合物结构信息[19]。

针对呕吐物及粪便提取样品的总离子流色谱图如图1所示，可获得全部化合物的质谱信息[18]，但有效的化合物信息提取较为困难。如在呕吐物样品的总离子流图（图1A和B）中， 未观察到信噪比高的色谱峰； 在粪便样品的总离子流图（图1C和D）中，虽然呈现具有一定信噪比的峰，但经与空白样品比对及谱图解析，为胆红素、胆汁酸和增塑剂等，系内源性化合物与背景干扰。这也反映了生物基质复杂、毒性化合物浓度一般较低、其信号经常被噪音掩盖的特点。

3.3 自动谱峰识别与谱库检索

针对DIA模式下的总离子流色谱图，可以通过选择合适算法及参数，进行谱峰的自动识别及处理。目前，已开发应用的HRMS商业化检索软件及谱库有MassHunter（Agilent）[20，21]、 PeakView（AB SCIEX）[22，23]、 TargetAnalysis（Bruker）[24]等。本研究采用UNIFI软件筛查平台，通过峰提取、母子离子峰精确质量对比、保留时间、化合物加合方式等内置算法，将化合物的相关质谱信息从海量的质谱数据中提取出来，并进行谱库检索。将MassLynx采集的MSE数据导入到UNIFI软件中，按照2.3.2项建立的数据库进行搜索、匹配，结果见表1。

由表1可知，在两份样品中除分别检出色氨酸、酪氨酸及色胺等蛋白质水解及代谢产物外，均检出了有毒生物碱α茄碱，其精确质量及保留时间与参考品及数据库信息均符合（±5 ppm）。考虑到茄碱中毒特征为呕吐、腹泻以及剧烈的腹痛等[25]，与患者症状较为相似，从而初步确定α茄碱可能是导致死亡的疑似毒物，并进一步对α茄碱所属的龙葵素类有毒化合物开展后靶向筛查鉴定。

3.4 龙葵素类有毒化合物的后靶向筛查鉴定

α茄碱系常存在于马铃薯等茄科植株及其块茎中的有毒糖苷类龙葵素生物碱之一，主要分为茄碱和卡茄碱两种，均以茄啶为糖苷配基而构成，具体包括α茄碱与其部分水解产物β茄碱和γ茄碱，α卡茄碱及其部分水解产物β卡茄碱和γ卡茄碱等[25]。α卡茄碱是龙葵素中主要的致毒成分，其毒效为α茄碱的3～10倍[26]，考虑到两者的体内水解代谢途径，推测呕吐物及粪便样品中可能同时存在α茄碱及其水解产物、α卡茄碱及其水解产物及共同水解产物茄啶。因此，进一步针对龙葵素类化合物进行了后靶向筛查。在原始谱图中针对性地提取了下述化合物的分子离子峰： α茄碱m/z 868.5058、 β茄碱m/z 722.4479、 γ茄碱m/z 560.3951、 α卡茄碱m/z 852.5109、 β卡茄碱m/z 706.4530、 γ卡茄碱m/z 560.3951、 茄啶m/z 398.3423，其提取离子流色谱图如图2所示。结果显示，呕吐物中检出α茄碱、 α卡茄碱、 β卡茄碱、 γ茄碱/卡茄碱和茄啶； 在粪便中检出α茄碱、 α卡茄碱、 β卡茄碱和茄啶。其中，γ茄碱与γ卡茄碱互为同分异构体，且裂解行为相似，本文未对其做区分鉴定。根据化合物的体内代谢途径，样品中测得各化合物的合理相关性分析将有助于中毒原因的确证。在粪便样品中并未检测到γ茄碱/卡茄碱，可能原因是γ茄碱/卡茄碱不稳定，在肠道内全部转化成茄啶。Nishie等[27]在大鼠口服茄碱毒性实验中也发现，茄碱可通过尿液和粪便快速排泄，且茄碱在胃肠道中被水解成毒性较弱的茄啶。

3.5 验证与半定量分析

在LCQOrbitrap MS/MS PRM模式下，选择5种化合物的母离子质荷比（α茄碱m/z 868.5058、 α卡茄碱m/z 852.5109、 β卡茄碱m/z 706.4530、 γ茄碱/卡茄碱m/z 560.3951和m/z 398.3423）作为母离子获取二级质谱图及碎片离子信息，结果表明，在两个样品中均检出疑似化合物，与QTOF结果相符，验证了这些化合物存在。通过对上述化合物的二级质谱碎片离子进行归属，上述化合物的结构及二级质谱图、 裂解途径见图3。同时，采集α茄碱参考品的高分辨质谱图，与样品中测得的α茄碱的二级子离子图谱进行相似度比对（图4），经NIST软件的计算相似度结果为93.5%。

采用单点校正法，通过PRM模式对呕吐物与粪便中测得的α茄碱进行定量，以m/z 868.5058离子峰的峰面积进行半定量，计算出两个样品的浓度均约为0.1 mg/kg。Wang等[28]针对荧光基团标记的N糖基化修饰蛋白，研究其PNGase F酶酶解片段的相关质谱行为，发现在反相C18色谱柱酸性流动相条件下分析N糖基化肽段时，其质谱响应仅与标签上的荧光基团相关，而与糖基的糖型和链长无关，即糖基对质谱响应的贡献可以忽略。因此，考虑到系列龙葵素化合物仅存在糖基数目或类型的差异，主要结构单元基团均为茄啶（m/z 398.3423），故可以假设龙葵素类化合物的质谱响应贡献主要来自茄啶基团。因此，以茄碱为外标，通过归一化法对茄碱及其水解产物进行半定量测定，测得呕吐物与粪便样本中龙葵素总量分别约为0.5和0.6 mg/kg。

4 结 论

采用高分辨质谱非信息依赖数据采集后靶向筛查策略，成功地将本方法应用于不明原因食物中毒致死案件的毒物鑒定。高分辨质谱的非信息依赖型数据采集可提供尽可能多的化合物海量数据信息，多模式内置算法使大容量谱库检索转换为有效的谱峰识别，从而实现快速锁定疑似毒物； 基于代谢途径的毒性相关化合物后靶向筛查策略，成功实现了不明原因食物中毒的毒物鉴定。鉴定的龙葵素类有毒化合物，是一类常见于马铃薯植株及其块茎中的有毒糖苷生物碱，毒物检测结果与中毒患者所出现临床症状相吻合，故推断本例食物中毒事件是由一系列龙葵素有毒生物碱引起的。本实验所建立的基于高分辨质谱快速筛查策略可为不明原因食物中毒的未知毒物快速筛查鉴定提供有效的技术支持。endprint

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Abstract Based on ultrahighperformance liquid chromatographyquadrupole/time of flight mass spectrometry （UPLCQTOF MS/MS）， a post targeted screening strategy using high resolution mass spectrometry under data independent acquisition was established， and successfully applied to screen and identify unknown toxicants in food poisoning patients′ vomit and feces. After solvent extraction， the samples were separated and analyzed on a reversedphase C18 column using a gradient elution program of 5 mmol/L ammonium formate and 0.1% formic acid aqueous solution （A） and 0.1% formic acid in acetonitrile solution （B）. Allions MS/MS information of samples was obtained using QTOF MS （ESI+） in MSE mode， followed by peak recognition and library searching using the UNIFI Scientific Information System， as a result， suspected toxic compound αsolanine was primarily detected. Furthermore， the related chemicals including hydrolysates and metabolites were identified in both samples based on posttargeted screening strategy， such as αchaconine， βchaconine， γsolanine/chaconine and solanidine. The concentration of αsolanine in both samples was approximately 0.1 mg/kg by onepoint calibration method， the total amount of solanine analogues in two samples was about 0.5 mg/kg and 0.6 mg/kg respectively through normalization of peak area. The high resolution mass spectrometry screening strategy established here could provide efficient screening method for rapid detection and identification of toxicants in unknown food poisoning.

Keywords Post targeted screening； Unknown toxicants； Biomedical samples； Solanine； Ultrahighperformance liquid chromatographyquadrupoletime of flight mass spectrometry

（Received 3 August 2017； accepted 26 September 2017）endprint