Box-Behnken法优选川乌、草乌、马钱子超声提取工艺△

汪坤，赵旭，王楠斐，胡昌江

(1.成都中医药大学，四川 成都 611137；2.河南省中医院，河南 郑州 450002)

现代药理研究表明，川乌[1]、草乌[2]、马钱子[3]均具有抗炎、镇痛和抗肿瘤作用，为中医临床治疗癌症和缓解癌性疼痛的常用药物。河南省中医院肿瘤科以川乌、草乌、马钱子为主药研制的消积止痛膏缓解癌性疼痛效果显著，但原制剂为黑膏药，现拟把饮片进行提取之后制成巴布剂。

文献报道中有同时提取川乌、草乌，单独提取马钱子的工艺研究，而尚未有对三者同时提取的研究。本研究拟同时提取3种饮片，以乌头碱、士的宁、马钱子碱提取量的综合评分为指标，优选提取工艺，为同时包含川乌、草乌、马钱子的中药制剂开发提供理论基础。

川乌、草乌的药效成分为乌头碱等双酯型生物碱类成分，该类成分易水解，当溶剂的pH值、温度升高可以加速其水解过程[4-5]；马钱子的药效成分为士的宁、马钱子碱等生物碱类成分[5]。本实验采用超声提取法，以酸水为溶媒，在低温、低pH值的条件下优化川乌、草乌、马钱子的提取工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Aglient-1260高效液相色谱仪(二极管阵列检测器)；AE240型十万分之一电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)；PL-S60超声波清洗机(东莞康士洁超声波科技有限公司)。

1.2 试药

乌头碱对照品、士的宁对照品、马钱子碱对照品(四川维克奇生物科技有限公司，批号分别为110718-201108、110718-201108、110718-201108，纯度均≥98%)；乙腈、甲醇为色谱纯；水为娃哈哈饮用纯净水。

川乌、草乌、马钱子购于亳州药材市场，经河南省中医院黄小敏副主任中药师鉴定分别为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的干燥母根、毛茛科植物北乌头AconitumkusnezoffiiReichb.的干燥块根、马钱科植物马钱Strychnosnux-vomicaL.的干燥成熟种子。

2 方法

2.1 色谱条件

AgilentTC-C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸二氢钠(B)；采用梯度洗脱(0～10 min，12%A；10～11 min，12%A→36%A；11～18 min，36%A；18～20 min，36%A→12%A)；检测波长分别为0～8 min时260 nm(测定士的宁、马钱子碱)，8～20 min时235 nm(测定乌头碱)；柱温25 ℃，流速1 mL·min-1。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称乌头碱、士的宁、马钱子碱对照品，色谱甲醇定容置于容量瓶中，质量浓度分别为0.2、0.0168、0.05 mg·mL-1。

2.3 供试品溶液的制备

称取草乌、川乌各3 g，马钱子1 g，按照正交试验设计的条件进行超声提取，提取液氨水碱化后过滤，滤液三氯甲烷萃取后收集三氯甲烷层，定容于50 mL容量瓶中，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.4 阴性样品溶液的制备

分别称取川乌、草乌，马钱子，按照2.3项下方法制备缺川乌、草乌，缺马钱子阴性样品溶液。

2.5 专属性试验

取混合对照品溶液、样品溶液及阴性对照品溶液，按上述色谱条件分别进样分析，士的宁、马钱子碱、乌头碱峰形对称，无杂质干扰且基线平稳，保留时间分别为6.72、7.49、14.69 min，见图1，方法专属性良好。

注：A.混合对照品；B.样品；C.缺马钱子阴性样品；D.缺川乌、草乌阴性样品；1.士的宁；2.马钱子碱；3.乌头碱。图1 混合对照品、样品、阴性样品HPLC图

2.6 标准曲线的制备

分别精密移取2.2项下混合对照品溶液0.6、1.0、1.2、1.8、2.0 mL于10 mL容量瓶中，用色谱甲醇定容至刻度，制得不同浓度的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，计算峰面积值，并以混合对照品溶液浓度(X)对峰面积值(Y)回归，得回归方程见表1。

表1 线性关系

2.7 精密度试验

取对照品溶液重复进样6次，每次10 μL，按2.1项下色谱条件测定，计算乌头碱、士的宁、马钱子碱峰面积的RSD分别为1.35%、1.11%、1.08%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

称取草乌、川乌各3 g，马钱子1 g，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别放置0、2、4、6、8、10 h后进样，进样量10 μL，按2.1项下色谱条件测定，计算乌头碱、士的宁、马钱子含量的RSD值分别为1.68%、2.37%、2.54%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.9 重复性试验

称取样品6份，其中草乌、川乌各3 g，马钱子1 g，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，按2.1项下色谱条件测定，计算乌头碱、士的宁、马钱子含量的RSD值分别为2.22%、1.97%、1.78%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

取已知乌头碱、士的宁、马钱子含量的样品6份，分别加入一定量乌头碱、士的宁、马钱子碱对照品溶液，按照供试品溶液制备方法制备样品溶液，分别进样10 μL，按照2.1项下色谱条件条件测定，计算平均加样回收率分别为2.17%、2.26%、1.98%。

3 实验结果

3.1 单因素试验

3.1.1 超声功率 固定盐酸水浓度为1.5%，加液量10倍，提取时间1 h，称取样品5份，草乌、川乌各3 g，马钱子1 g。按照供试品溶液的制备方法分别在超声功率200、300、400、500、600 W下提取制备样品溶液，分别进样10 μL，按2.1.1项下色谱条件测定，计算乌头碱、士的宁、马钱子含量，结果见表2，发现超声功率600 W时提取效率最佳。

表2 超声功率对川乌、草乌、马钱子提取的影响

3.1.2 酸浓度 固定提取时间1 h，加液量10倍，称取样品5份，草乌、川乌各3 g，马钱子1 g。分别加入0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的盐酸水溶液，超声功率600 W，按照供试品溶液的制备方法制备样品溶液。分别进样10 μL，按2.1.1项下色谱条件测定，计算乌头碱、士的宁、马钱子含量，结果见表3。选择盐酸水浓度1%、1.5%、2%为星点设计-响应面法试验的水平条件。

表3 酸浓度对川乌、草乌、马钱子提取的影响

3.1.3 提取时间 固定盐酸水浓度为1.5%，加液量10倍，称取样品5份，草乌、川乌各3 g，马钱子1 g，超声功率600 W，按照供试品溶液的制备方法分别提取0.5、1、1.5、2、2.5 h，制备样品溶液，分别进样10 μL，按2.1.1项下色谱条件测定，计算乌头碱、士的宁、马钱子含量，结果见表4，选择提取时间1、1.5、2 h为星点设计-响应面法试验的水平条件。

表4 提取时间对川乌、草乌、马钱子提取的影响

3.1.4 加液量 固定盐酸水浓度为1.5%，提取时间1 h，称取样品5份，草乌、川乌各3 g，马钱子1 g，分别加入6、8、10、12、15倍量的盐酸水溶液，超声功率600 W，按照供试品溶液的制备方法制备样品溶液，分别进样10 μL，按2.1.1项下色谱条件测定，计算乌头碱、士的宁、马钱子含量，结果见表5，选择加液量8、10、12倍为星点设计-响应面法实验的水平条件。

表5 加液量对川乌、草乌、马钱子提取的影响

3.1.5 提取次数 固定盐酸水浓度为1.5%，加液量10倍，提取时间1 h，称取样品5份，其中草乌、川乌各3 g，马钱子1 g，按照供试品溶液的制备方法分别提取1、2、3次，制备样品溶液，分别进样10 μL，按2.1.1项下色谱条件测定，计算乌头碱、士的宁、马钱子含量，提取两次后乌头碱、士的宁、马钱子的提取率达到90%以上，为了降低成本、提高生产效率，因此选择提取2次。

3.2 星点设计-响应面法优化川乌、草乌、马钱子超声提取工艺

3.2.1 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，以酸水浓度(A)、提取时间(B)、加液量(C)为因变量，乌头碱、士的宁、马钱子提取量的综合评分为相应值设计三因素三水平中心复合试验，见表6。

表6 Box-Behnken试验因素水平表

3.2.2 响应面试验结果及方差分析 根据Box-Behnken法设计方案及2.1.3项下供试品溶液的制备方法进行实验，测定乌头碱、士的宁、马钱子碱的含量，计算综合评分，响应试验结果见表7。采用Design Expert 8.06软件对所得数据进行回归分析，方差分析结果见表8。

表7数据经Design Expert 8.0.6软件回归分析，并进行拟合，得到以上3个因素对提取工艺综合评分影响的回归模型方程：Y=0.222 7+0.508 85A+0.418 35B+0.011 625C-0.064AB-2.75×10-3AC-3.75×10-3BC+3.750×10-3-0.133A2-0.127 2B2-5.125×10-4C2，方差分析结果见表8所示。

由表8可知，B、A2、B2对综合评分的的影响极显著(P<0.01)，A、AB对综合评分的的影响较显著(P<0.05)。本实验模型回归P值为<0.01，说明模型回归显著可靠；失拟误差P值为0.027 7>0.05，说明失拟度不明显；说明该方程拟合度较高，实验误差较小，该模型可以有效地对川乌、草乌、马钱子提取工艺进行分析和预测。

表8 回归系数的显著性检验

注：*P<0.05为显著水平，**P<0.01为极显著水平。

3.2.3 响应面分析 经 Design Expert 8.0.6软件回归分析，分别绘制各指标与响应值的响应曲面图，用来确定各因素对川乌、草乌、马钱子提取工艺综合评分的影响，结果见图2～4。由图可知，提取时间一定时，综合评价结果随酸浓度的增加先升高后降低；加液量一定时，综合评价结果随提取时间的增加先升高后降低；酸浓度一定时，综合评价结果随超声功率的增加先升高后趋于平稳。

图2 提取时间与酸浓度交互作用的响应面图

图3 加液量与酸浓度交互作用的响应面图

图4 加液量与提取时间交互作用的响应面图

3.2.4 工艺验证 经 Design Expert 8.0.6软件得到的回归方程，求解得到草乌、川乌、马钱子最佳超声提取工艺：以1.41%的盐酸水为溶媒，超声功率600 W，11.99倍加液量提取2次，每次1.46 h，此时综合评分的预测值为0.968。根据实际生产情况修正最佳提取工艺：1.4%的盐酸水为溶媒，超声功率600 W，12倍量的加液量提取2次，每次1.5 h。

按修正工艺进行3批验证，结果见表9，综合评分平均值为0.961，RSD值为0.82%。结果表明，建立的综合评分与酸浓度、加液量和提取时间之间关系的回归模型是科学合理的。

表9 验证实验结果

4 讨论

川乌、草乌所含的药效成分乌头碱易水解，随着温度的升高，水解速度加快。目前对川乌、草乌常用的提取方法有冷浸法[7]、超声提取法、渗漉法、回流提取法等，其中回流提取法乌头碱水解速度较快；而冷浸法、渗漉法所用溶剂较多，用时较长，因此本实验采用超声波提取法，提取效率较高。

马钱子的提取工艺研究中采用的溶剂有水、酸水、乙醇等，酸水提取效率略低于乙醇提取，但二者之间无显著差异[8]。

本实验采用超声提取法用酸水提取川乌、草乌、马钱子中的生物碱类成分，浸泡时间较短，提取液同回流提取法相比较为粘稠，但采用减压过滤法可以快速过滤，优选的工艺简便易行，可以为制剂生产提供参考。

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