紫茎泽兰对萨能奶山羊血常规及重要脏器病理学的影响

符 杰，胡延春，陈伟红，翁嘉华，胡力文，石 真，何亚军，莫 全，王 娅，任志华，彭广能，左之才，邓俊良

(动物疫病与人类健康四川省重点实验室，环境公害与动物疾病四川省高校重点实验室，四川农业大学动物医学院，四川 温江 611130)

紫茎泽兰(Eupatoriumadenophorum)又名解放草、破坏草[1]等，是菊科泽兰属多年生草本植物。紫茎泽兰因其具有强大的生态适应性和入侵性，可通过释放化感物质影响土壤微环境，从而抑制其他植物的生长，甚至导致本土物种的消失[2]。经过几十年的发展，紫茎泽兰现已是我国排在首位的外来入侵物种，且在四川、重庆、广西、贵州等地危害最为严重[3]。紫茎泽兰作为世界性毒草，不仅侵占草地，造成山林退化，而且给畜牧业特别是草地畜牧业生产造成了严重损失[4]。在饲草匮乏的季节，日常的放牧或者喂食中，如果家畜误食紫茎泽兰或者含有紫茎泽兰的饲料，会导致牛、羊等其他家畜接触性皮炎[5]，有的患畜会出现精神消沉、腹泻、脱毛、消瘦、肌肉发生震颤或者强直性痉挛[6]、肝脏损伤[7-10]等相应的中毒症状及病理变化。而且，紫茎泽兰的花粉和种子还能诱发马属动物过敏性支气管炎[11]。因此，紫茎泽兰不仅会造成当地植物灾难性的破坏，同时也给畜牧业带来较为严重的损失。

国内外对紫茎泽兰引起反刍动物中毒的毒性作用还未进行系统研究，对萨能奶山羊(Saanen goat)血常规及主要实质器官的病理学影响研究也未见详细报道。本研究探讨紫茎泽兰对萨能奶山羊血常规及肝、脾、肾等脏器病理学的影响，旨为进一步研究反刍动物紫茎泽兰中毒机理及紫茎泽兰防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选择体重相近、体格健康、5～6月龄的萨能奶山羊16只、公母各半，随机分成公母各半的对照组及试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组，每组4只；有研究表明，脱毒的紫茎泽兰可作为饲料代替小麦麸[12]，且根据韩龙等[13]与周自玮等[14]的研究结果，将山羊日粮与添加料设为20%∶80%(表1)，对照组动物采食基础日粮，试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组动物每天分别饲喂添加自然风干后用粉碎机粉碎，未脱毒的紫茎泽兰粉(采自四川省凉山州西昌市黄联关镇)的日粮。试验于2014年4月12日至2014年7月29日在四川省成都市温江区四川农业大学进行。试验预试期2周，正试期12周。

1.2 饲养管理

16只试验奶山羊进行常规免疫及驱虫后集中饲养于已消毒的养殖场地，统一饲养管理。每天分别在09:00和17:00各饲喂一次，饲喂期间不限采食和饮水。每只每次投喂0.5 kg试验饲料，共计1 kg·d-1，定量饲喂。每天对羊圈进行清扫，保持其干燥清洁。按照萨能奶山羊地方饲养标准选购山羊日粮饲料(日粮饲料原料为风干状态)，试验日粮组成及营养水平如表2所列。

表1 试验饲料配比Table 1 Ratios of experimental feed

表2 试验日粮组成及营养水平Table 2 Composition and nutrient levels of the experimental diet

1.3 血液生理指标的测定

试验期每隔14 d，于晨后对每组萨能奶山羊进行空腹颈静脉采血2 mL，用真空(肝素钠)抗凝管进行抗凝，分别采用试管稀释法，sahli比色法以及硝基四唑氮蓝(NBT)还原法测定血液中的白细胞(WBC)、血红蛋白(HGB)及中性粒细胞(NEUT)含量。

1.4 统计分析

所有试验数据经过Excel初步处理后，利用SPSS 17.0统计软件One-way ANOVA程序进行单因素方差分析，差异显著时采用Duncan法进行多重比较，试验结果以(平均值±标准差)并标以显著水平表示。

1.5 组织病理学观察

将全部萨能奶山羊进行颈静脉放血处死，进行解剖检查，观察组织器官有无明显的病理变化。将采集的对照组与试验组奶山羊的肝、脾、肾经4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，甲苯透明，石蜡包埋，5 μm切片，HE常规染色后，于光镜下观察并记录其组织学变化。最后,将饲喂不同紫茎泽兰比例的试验组和对照组进行观察比较，并记录观察结果。

2 结果与分析

2.1 对萨能奶山羊血常规的影响

2.1.1白细胞(WBC)变化 试验Ⅰ组在试验56与84 d时白细胞数极显著高于对照组(P<0.01)，于70 d时显著高于对照组(P<0.05)(表3)。试验Ⅱ、Ⅲ组血液中白细胞数目均在试验42 d显时著高于对照组(P<0.05)，且从试验56 d开始到84 d，试验Ⅱ、Ⅲ组极显著高于对照组(P<0.01)。

2.1.2淋巴细胞(LY)变化 试验Ⅰ组56 d至70 d显著低于对照组(P<0.05)，且在试验84 d时极显著低于对照组(P<0.01)(表4)。试验Ⅱ、Ⅲ组血液中LY数目均于试验42 d时显著低于对照组(P<0.05)，当试验从56 d进行到84 d，试验Ⅱ、Ⅲ组表现为极显著低于对照组(P<0.05)。

表3 各组萨能奶山羊血液中白细胞(WBC)的变化Table 3 Changes in white blood cell count for each group

同行中的*和**分别表示试验组与对照组差异显著(P<0.05 )和极显著(P<0.01 )。表4、表5和表6同。

* and ** within the same row indicate significant difference between control group and treatment group at 0.01 and 0.05 level, respectively; this applies to Table 4, Table 5, and Table 6.

表4 各组萨能奶山羊血液中淋巴细胞(LY)的变化Table 4 Changes in LY for each group

2.1.3中性粒细胞(NEUT)变化 整个试验阶段，试验Ⅰ组在试验56 d时显著高于对照组(P<0.05)(表5)。在试验84 d时，试验Ⅰ组NEUT数目极显著高于对照组(P<0.01)。试验Ⅱ、Ⅲ组血液中NEUT数目均在试验42 d时显著高于对照组(P<0.05)，分别于试验70 d、56 d至试验结束NEUT数目极显著高于对照组(P<0.01)。

2.1.4血红蛋白(HGB)含量变化 试验Ⅰ组在试验56 d到70 d显著低于对照组(P<0.05)，在试验84 d时极显著低于对照组(P<0.01)(表6)。与对照组相比，试验Ⅱ、Ⅲ组在试验28 d时均显著低于对照组(P<0.05)，而且均从试验42 d到84 d极显著低于对照组(P<0.01)。

2.2 对主要脏器的病理学影响

2.2.1肝脏 各试验组山羊肝脏随紫茎泽兰饲喂剂量增加而色泽变淡，表面有褐色斑点，并未见明显出血点。在试验组Ⅰ中，肝细胞明显肿胀，部分肝细胞溶解、坏死，肝索排列紊乱，肝窦狭窄甚至闭锁，部分肝窦淤血。试验组Ⅱ中，肝细胞主要为水泡变性。试验组Ⅲ中，肝细胞脂肪变性，部分发生凝固性坏死，并伴有中性粒细胞浸润(图1)。由此可见，随着试验时间延长，各试验组肝脏病变越发严重。

表5 各组萨能奶山羊血液中性粒细胞(NEUT)的变化Table 5 Changes in NEUT for each group

表6 紫茎泽兰对奶山羊血红蛋白(HGB)的影响Table 6 Effect of Eupatorium adenophorum on HGB in Saanen goat

图1 各组萨能奶山羊肝脏病理变化Fig. 1 Histopathological changes in the liver for each group of Saanen goats

A：对照组肝细胞，×400，HE；B：①肝细胞肿胀明显，②肝细胞溶解、坏死，肝索排列紊乱，③肝窦狭窄闭锁，肝窦淤血，×400，HE；C：肝细胞水泡变性，×400，HE；D：④肝细胞凝固性坏死，⑤脂肪变性，⑥中性粒细胞浸润，×400，HE。

A：Liver cells of control, ×400, HE; B: ①Some hepatic cells are tumid, ②dissolved and necrotic, ③the hepatic cords is narrow, blocked and congested in Trial Ⅰ, ×400, HE; C: Vacuolar degeneration of liver cells in Trial Ⅱ, ×400, HE; D: ④Coagulation necrosis, ⑤steatosis and ⑥neutrophil infiltration of liver cells in Trial Ⅲ, ×400, HE.

2.2.2脾脏 与对照组相比，各试验组有脾脏轻度肿大，被膜增厚，色泽变淡的现象。各试验组均出现脾组织严重充血，红髓区充血。试验组Ⅰ还伴有淋巴细胞减少的现象。试验组Ⅱ红髓区且噬细胞数量增多，试验组Ⅲ则出现含铁血黄素增多(图2)。由此可见，随着试验时间延长，各试验组脾脏病变越发严重。

2.2.3肾脏 各试验组肾脏均出现不同程度肿大，质地变柔，被膜紧张。组织切片可观察到试验组Ⅰ中肾小管发生充血，肾小管上皮细胞肿胀。试验组Ⅱ中间质小静脉和毛细血管扩张淤血，肾组织伴有颗粒变性和水泡变性的现象。试验组Ⅲ中肾小球细胞淤血，间质淤血，部分肾小管上皮细胞坏死(图3)。

图2 各组萨能奶山羊脾脏病理变化Fig. 2 Histopathological changes in the spleen for each group of Saanen goats

A：对照组为正常脾组织×400，HE；B：试验组Ⅰ中①红髓区充血，②淋巴细胞数量减少，×400，HE ；C：试验组Ⅱ中③脾组织严重出血，④红髓区巨噬细胞数量增多，×400，HE；D：试验组Ⅲ中⑤红髓区充血，⑥含铁血黄素增多，×400，HE。

A: Spleen of control ×400, HE; B: ①Congestion of the red pulp, ②lymphocytes decreased in TrialⅠ， ×400, HE; C: ③The splenic tissue was bleeding and ④macrophages increased in the red pulp in TrialⅡ， ×400, HE; D: ⑤Congestion of the red pulp, ⑥hemosiderin increased in spleen in Trial Ⅲ×400, HE.

图3 各组萨能奶山羊肾脏病理变化Fig. 3 Histopathological changes in the kidney for each group of Saanen goats

A：对照组肾组织，×400，HE；B：①肾小管充血，②肾小管上皮细胞肿胀，×400，HE；C：③间质小静脉，④毛细血管淤血，⑤肾小管上皮细胞水泡变性，×400，HE；D：⑥肾小球细胞淤血，⑦间质淤血，⑧肾小管上皮细胞坏死，×400，HE。

A:Kidney of control, ×400, HE; B: ①The renal tubules were congested and ②the renal tubular epithelial cells swelled, ×400, HE; C: ③Stromal venules and ④capillaries congestion, ⑤vacuolar degeneration of renal tubular epithelial cells, ×400, HE; D: ⑥Glomerular cell and ⑦stromal congestion, ⑧necrosis of renal tubular epithelial cells, ×400, HE.

3 讨论与结论

四川凉山彝族自治州是紫茎泽兰重灾区之一，紫茎泽兰的疯狂传播生长致使凉山的绝大部分山林田地以及牧场被侵占，牲畜被迫采食而中毒的事件也屡屡发生，给牧民造成了严重的经济损失。研究表明，紫茎泽兰全草所含有的有毒成分主要包括9-羰基-10,11-去氢泽兰酮(Euptox A)、佩兰毒素、香豆精、鞣质，还有生物碱类等[15]，其中分离到的Euptox A对牲畜有剧毒，它是导致肝损伤的主要毒素[16-19],也会造成动物的其他器官和组织的毒性损伤，严重时甚至导致动物死亡。

本研究通过给予对照组奶山羊饲喂全价饲料，试验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别饲喂40%(0.4 kg·d-1)、60%(0.6 kg·d-1)、80%(0.8 kg·d-1)剂量紫茎泽兰日粮，结果表明，各试验组的LY值于试验后期均极显著低于对照组(P<0.01)，NEUT显著升高(P<0.05)，后期极显著高于对照组(P<0.01)。这说明不同剂量的紫茎泽兰均可能对萨能奶山羊机体免疫系统造成影响。试验动物采食紫茎泽兰中毒后，其机体免疫能力下降，导致机体易受致病菌等的入侵而引发各种炎症反应。通过比较各试验组值可以看出，紫茎泽兰能显著引起萨能奶山羊WBC值升高，而且存在明显时间和剂量效应，紫茎泽兰添加量越高、饲喂时间越长，白细胞值越高，试验组Ⅲ最为明显，说明当长期采食紫茎泽兰可引起萨能奶山羊机体持续性炎症反应，导致白细胞水平升高。这与周自玮等[14]的研究结论一致。整个试验阶段，随着紫茎泽兰剂量的增加，HGB水平表现为下降越明显，说明紫茎泽兰对机体的造血功能产生较显著影响，这与李厚勇等[20]研究结论一致。

另一方面，本研究通过对紫茎泽兰中毒的萨能奶山羊组织切片进行观察，发现紫茎泽兰对试验组萨能奶山羊主要实质性器官肝、脾、肾脏的组织结构具有损害作用，可导致各器官的功能性细胞变性与坏死，这就表明紫茎泽兰对反刍动物——萨能奶山羊具有毒性作用，可对奶山羊造成肝肾毒性，影响其机体正常的新陈代谢功能，从而导致奶山羊的生长异常。董强等[21]也报道了用紫茎泽兰全草饲喂小鼠后会造成小鼠生长缓慢，肝、肾等也呈现不同程度的病理损害。紫茎泽兰虽然是良好的饲料来源，但未脱毒的紫茎泽兰不适宜作为食草动物的饲料[22]。

综上，本研究通过向萨能奶山羊日粮中添加不同剂量的紫茎泽兰粉，结果导致了试验组奶山羊肝、脾、肾器官出现不同程度的病理损伤，而试验组奶山羊血液指标的改变也表明了采食紫茎泽兰会造成试验动物中毒，这为进一步完善紫茎泽兰引起山羊中毒的毒理学研究以及紫茎泽兰的开发利用提供了理论基础。

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