应用消化系统全仿生模型分析酸奶发酵对钙形态的影响

陈尚龙，陈安徽，刘 辉，刘恩岐，巫永华，秦 旭

0 引 言

Ca是人体第5大营养元素，也是人体骨骼的重要成分，约占人体质量的1.8%，它对调节生理功能和维持健康具有重要意义[1]，如何科学地补Ca一直都是研究热点。之前，对食品中Ca的分析多限于总量测定[2-3]，形态分析较少。近年来相关研究报告[4-10]表明，无机态有益元素不易被人体吸收，生物活性低，摄入不当还会引起疾病；而有机态有益元素易被人体吸收[11]，对人类科学地补充有益元素有着更重要的意义。但牛奶在发酵成酸奶后，其中富含的有机Ca是否发生改变，对补Ca而言是否有利，这方面的研究报道甚少。

本试验以市售纯牛奶和实验室发酵的酸奶为研究对象，采用体外全仿生消化（含消化酶）技术[12-15]对其进行预处理，研究酸奶发酵对Ca形态和生物可给性的影响。正辛醇在结构上与人体内的碳水化合物和脂肪类似[16]，试验以正辛醇模拟细胞膜，建立正辛醇吸收模型，模拟纯牛奶和酸奶中Ca在人体胃、肠中的吸收；鉴于消化道和血管间的生物膜为类脂质膜[17-19]，试验以单层脂质体模拟细胞膜，建立单层脂质体吸收模型，模拟纯牛奶和酸奶中Ca在人体胃、肠中的吸收。采用微波消解作为前处理方式，使用连续光源火焰原子吸收光谱法（continuum source flame atomic absorption spectrometry，CS FAAS）[20-27]测定各形态Ca的质量分数，为科学补Ca提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售纯牛奶，实验室自制酸奶（以上述纯牛奶为原料发酵制得）。

高峰α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶、脂肪酶、猪胆粉、氨基葡萄糖盐酸盐、尿酸、粘蛋白、牛血清白蛋白、葡萄糖醛酸、尿素、硫氰酸钾、卵磷脂（均为分析纯） 上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、丙酮、无水葡萄糖、盐酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠、无水氯化钙、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、氯化铵、磷酸三钠、氯化镁、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、正辛醇（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司；浓硝酸、30%（体积分数，下同）过氧化氢、KCl、La(NO3)3（均为优级纯），国药集团化学试剂有限公司；乳酸菌酸奶发酵剂，北京川秀科技有限公司；绵白糖（食品级），徐州人和居食品厂；Ca标准溶液（1 g/L），国家化学试剂质检中心。

1.2 仪器与设备

ContrAA700高分辨-连续光源原子吸收光谱仪（配MPE60自动进样器，简称HR-CSAAS），德国Analytik Jena公司；XT-9900型智能微波消解仪、XT-9800多用预处理加热仪，上海新拓微波溶样测试技术有限公司；Cascada实验室超纯水系统，美国Pall公司；SIGMA3-30K台式高速冷冻离心机，德国SIGMA公司；L550台式低速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 仪器工作条件

使用HR-CS AAS（火焰法）测定Ca的工作条件：波长为422.672 8 nm，火焰类型为C2H2-Air，燃烧器类型为100 mm。

在使用HR-CS AAS测定Ca时，流量比（乙炔/空气）和燃烧器高度都是影响测定结果的重要参数[1]。由于ContrAA 700 HR-CS AAS的空气流量为470 L/h，无法调节，改变流量比只能通过调节乙炔流量。通过优化，试验选择最佳乙炔流量为70 L/h，最佳燃烧器高度为6 mm。

1.3.2 标准工作曲线的配制

用0.5% HNO3将Ca标准溶液（1 g/L）进行逐级稀释，配制成0～10 mg/L的标准系列溶液，并向其中添加KCl和La(NO3)3溶液[1]，使其都含有质量分数1% KCl和质量分数0.5% La(NO3)3。

1.3.3 酸奶发酵

工艺流程：纯牛奶→配料→杀菌→冷却→接种→搅拌→灌装→发酵→冷藏→成品。

操作要点：本试验以分析所用纯牛奶为原料，加入质量分数4%绵白糖，溶解后煮沸5 min以达到杀菌效果。冷却至室温后加入质量分数0.1%乳酸菌酸奶发酵剂，搅拌混匀后将其装入玻璃罐中（高温杀菌），密封，放入 45℃恒温培养箱中，培养6 h后转移至冰箱中冷藏备用。

1.3.4 样品前处理及其Ca的测定

将样品（5～10 g，精确至0.1 mg）、浓HNO3（5～10mL）和30% H2O2（2～5 mL）一起置于微波消解罐中，在多用预处理加热仪上进行预处理0.5～1 h，温度由室温逐级上升至120℃。再加入2 mL 30% H2O2，按表1中条件进行微波消解，结束后将溶液转移至50 mL烧杯中加热至近干，用0.5% HNO3溶液多次冲洗烧杯中的样液，并将冲洗液转移至25 mL容量瓶中，用0.5% HNO3溶液定容至刻度，摇匀备用，同时以同样方法做空白对照[27]。根据Ca浓度的高低，用0.5% HNO3溶液对其进行适当倍数的稀释，稀释时向其中添加KCl和La(NO3)3溶液，使其都含有质量分数1% KCl和质量分数0.5% La(NO3)3，然后再用HR-CS FAAS进行测定。

表1 微波消解条件Table 1 Conditions of microwave digestion

在使用HR-CS AAS测定Ca时，为了消除磷酸根等离子的干扰，通常选择添加硝酸镧作为释放剂，镧离子可以与磷酸根形成磷酸镧，从而将Ca从磷酸钙中释放出来，干扰和释放反应方程如公式（1）～（2）[1]。

试验固定其他参数，只改变待测样品中硝酸镧质量分数，测定Ca的吸光度，如图1所示。

图1 硝酸镧质量分数对吸光度的影响Fig.1 Effect of La(NO3)3 mass fraction on absorbance

由图 1可知，硝酸镧质量分数对吸光度有较大的影响，试验选择待测样品中最佳硝酸镧质量分数为0.5%。

1.3.5 仿生液的制备

胃、肠全仿生消化液的制备：根据表2，分别加入唾液、胃液、十二指肠液和胆汁中所含的有机物和无机物，利用HCl和NaHCO3调整pH值，再用超纯水定容至500 mL，置于 4℃冷藏保存备用。使用前，在此基础上分别加入相应的消化酶。

胃全仿生提取液的制备：准确称取125 g纯牛奶（酸奶）置于1 000 mL三角瓶中，加入5.00 mL唾液，在37℃下恒温振荡5 min后（振荡速度为60 r/min），再加入75.0 mL胃液，在37℃下恒温振荡2 h（振荡速度为60 r/min），结束后离心20 min（离心速度为4 200 r/min）达到固液分离，得上清液（胃全仿生提取液），并称量质量，置于4℃冷藏保存备用。

肠全仿生提取液的制备：准确称取125 g纯牛奶（酸奶）置于1 000 mL三角瓶中，加入5.00 mL唾液，在37℃下恒温振荡5 min后（振荡速度为60 r/min），加入75.0 mL胃液，在37℃下恒温振荡2 h（振荡速度为60 r/min），再加入100.0 mL十二指肠液和40.0 mL胆汁，在37℃下恒温振荡7 h（振荡速度为 60 r/min），结束后离心20 min（离心速度为4 200 r/min）达到固液分离，得上清液（肠全仿生提取液），并称量质量，置于4℃冷藏保存备用。

1.3.6 不同形态Ca的分离和测定

可溶态与悬浮态的分离和测定：准确称取40 g全仿生提取液置于50 mL离心管中，离心10 min（离心速度为11 000 r/min）后取上清液，再过0.45 μm滤膜，得可溶态溶液[18]，并称量质量。按 1.3.4节方法对可溶态溶液进行消解和测定，测定结果为可溶态Ca质量分数，再将剩余可溶态溶液置于4℃冷藏保存备用。

悬浮态Ca = Ca总量 - 可溶态Ca （3）

可溶态中有机态和无机态的分离和测定：准确称取5.0 g可溶态溶液，过D101大孔吸附树脂（用2倍体积左右的无水乙醇浸泡24 h左右，去离子水冲至中性），用1% HNO3以2.0 mL/min的流速洗涤树脂，收集250 mL洗出液，按1.3.4节方法对洗出液进行消解和测定[28]，测定结果为可溶态中无机态Ca质量分数。

表2 唾液、胃液、十二指肠液、胆汁组成成分表[18,29]Table 2 Main components of saliva, gastric juice,duodenal juice and bile

1.3.7 吸收模型的制备及其体外吸收

正辛醇吸收模型的制备：取适量正辛醇与超纯水以体积比 1∶10进行混合，强力振荡均匀后转移至分液漏斗中，避光静置12 h待其分层，上层为被水饱和的正辛醇，下层为被正辛醇饱和的水，避光保存，备用。

正辛醇吸收模型的体外吸收：准确移取1.00 mL可溶态溶液置于50 mL离心管中，加入1.00 mL被水饱和的正辛醇和20.00 mL被正辛醇饱和的水，在37 ℃下恒温振荡5 h（震荡速度为250 r/min）后，再在4 ℃下恒温离心10 min（离心速度为11 000 r/min），结束后用胶头滴管吸去离心管上层正辛醇相，最后用超纯水将剩余溶液定容至25 mL，按1.3.4节方法对上述溶液进行消解和测定，测定结果为正辛醇吸收模型中水溶态Ca质量分数。

正辛醇吸收模型中分配系数 KOW值为正辛醇醇溶态Ca和正辛醇吸收模型中水溶态Ca的比值，KOW值越大，说明亲脂性Ca质量分数越高，越有利于人体吸收。

单层脂质体吸收模型的制备：准确称取0.001 g蛋黄卵磷脂溶于10.00 mL氯仿，溶解后将其转移至具塞圆底烧瓶中，然后置于 37 ℃真空旋转蒸发，直至形成均匀的多层脂质体膜。

单层脂质体吸收模型的体外吸收：准确移取5.00 mL可溶态溶液置于50 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度后，全部转移至上述圆底烧瓶中，充氮气后盖好涂有凡士林的塞子，在 37 ℃下恒温振荡 1 h（振荡速度为 100 r/min），使脂质体膜全部进入溶液中。然后将全部溶液转移至100 mL塑料管中，在超低温冰箱（-80 ℃）中冷冻20 min后取出，置于37 ℃水浴中融化，重复冻融3次，促进可溶态在单层脂质体-水体系中的分配。由于单层脂质体粒径为0.3～0.35 μm，用0.22 μm滤膜抽滤上述冻融液，收集滤液[18]，按1.3.4节方法对滤液进行消解和测定，测定结果为单层脂质体吸收模型中水溶态Ca质量分数。

单层脂质体亲和态Ca

= 可溶态Ca - 单层脂质体吸收模型中水溶态Ca （5）

单层脂质体吸收模型中分配系数DMW值为单层脂质体亲和态Ca和单层脂质体吸收模型中水溶态Ca的比值，DMW值越大，说明亲脂性Ca质量分数越高，越有利于人体吸收。

1.3.8 Ca生物可给性的计算

纯牛奶（酸奶）胃、肠全仿生提取液中Ca生物可给性的计算如式（6）。

式中BA为Ca的生物可给性，%；TK为纯牛奶（酸奶）胃、肠全仿生提取液中可溶态Ca质量分数，mg/g；

TZ为纯牛奶（酸奶）中Ca总量（mg/g）。

2 结果与分析

2.1 标准工作曲线的绘制

在选定工作条件下，使用HR-CS FAAS顺序测定Ca标准系列溶液。以质量浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标，经ASpect CS软件绘制非线性标准工作曲线，如图2所示，所得回归方程为A=(0.002 934 2＋0.047 136 5×c)/(1＋0.020 721 6×c)，特征浓度0.097 mg/L，相关系数为0.999 1，说明在0～10 mg/L范围内，Ca质量浓度与吸光度呈现良好的关系。

图2 标准工作曲线Fig.2 Standard working curves

2.2 加标回收率

在纯牛奶样品中加入一定量Ca标准溶液（加标水平为5.0 mg/g），然后置于微波消解罐中进行微波消解，按1.3.4节进行操作，重复6次。在选定工作条件下进行测定，计算加标回收率[30]，分别为96.3%、95.7%、97.8%、94.3%、95.7%和96.5%，平均加标回收率为96.1%，RSD=1.20%，表明使用该方法测定Ca，结果准确可靠。

2.3 纯牛奶、酸奶胃全仿生提取液中 Ca的形态分析及生物可给性

按上文方法分别对纯牛奶和酸奶进行处理，根据Ca的标准工作曲线计算出各形态Ca质量分数，同时通过t检验检验数据之间是否有显著差异，结果见表3。

表3 纯牛奶、酸奶胃全仿生提取液中各形态Ca质量分数及生物可给性Table 3 Speciation analysis and bioavailability assessment of Ca in gastric all bionic extraction solutions of milk and yogurt

由表3可知，纯牛奶和酸奶中都含有丰富的Ca，分别为 12.894±0.133 mg/g和15.920±0.157 mg/g，酸奶中Ca质量分数高于纯牛奶，这是由于试验在发酵酸奶时，没有添加增稠剂，导致大量的乳清析出，使酸奶质量变小，Ca质量分数变高。在纯牛奶胃全仿生提取液中可溶态 Ca为5.364 mg/g，其中有机态Ca占总量的26.95%，正辛醇醇溶态Ca和单层脂质体结合态Ca分别占总量的32.88%和33.71%，KOW值和DMW值分别为3.77和4.27，Ca的生物可给性为41.60%；在酸奶胃全仿生提取液中可溶态Ca为7.228 mg/g，其中有机态Ca占总量的36.80%，正辛醇醇溶态Ca和单层脂质体结合态Ca分别占总量的36.63%和38.10%，KOW值和DMW值分别为4.18和5.21，Ca的生物可给性为45.40%。

可溶态和无机态的t值都大于2.78，表明在0.05显著性水平上所测得结果的平均值显著差异；正辛醇吸收模型和单层脂质体吸收模型中水溶态的t值都小于2.78，表明在0.05显著性水平上所测得结果的平均值没有显著差异。

综上所述，在酸奶胃全仿生提取液中可溶态Ca、有机态Ca、正辛醇醇溶态Ca和单层脂质体结合态Ca的质量分数和所占总量百分比都高于纯牛奶，KOW值、DMW值和生物可给性也高于纯牛奶。因此，在胃消化阶段，酸奶的补Ca效果优于纯牛奶。

2.4 纯牛奶、酸奶肠全仿生提取液中 Ca的形态分析及生物可给性

按上文方法分别对纯牛奶和酸奶进行处理，根据Ca的标准工作曲线计算出各形态Ca质量分数，同时通过t检验检验数据之间是否有显著差异，结果见表4。

表4 纯牛奶、酸奶肠全仿生提取液中各形态Ca质量分数及生物可给性Table 4 Speciation analysis and bioavailability assessment of Ca in intestinal all bionic extraction solutions of milk and yogurt

由表4可知，在纯牛奶肠全仿生提取液中可溶态Ca为8.237 mg/g，其中有机态Ca占总量的45.36%，正辛醇醇溶态Ca和单层脂质体结合态Ca分别占总量的49.81%和54.35%，KOW值和DMW值分别为3.54和5.70，Ca的生物可给性为63.88%；在酸奶肠全仿生提取液中可溶态Ca为10.556 mg/g，其中有机态Ca占总量的47.91%，正辛醇醇溶态 Ca和单层脂质体结合态 Ca分别占总量的52.98%和57.14%，KOW值和DMW值分别为3.97和6.24，Ca的生物可给性为66.31%。

可溶态和正辛醇吸收模型中水溶态的 t值都大于2.78，表明在 0.05显著性水平上所测得结果的平均值显著差异；无机态和单层脂质体吸收模型中水溶态的t值都小于2.78，表明在0.05显著性水平上所测得结果的平均值没有显著差异。

综上所述，在酸奶肠全仿生提取液中可溶态Ca、有机态Ca、正辛醇醇溶态Ca和单层脂质体结合态Ca的质量分数和所占总量百分比都高于纯牛奶，KOW值、DMW值和生物可给性也高于纯牛奶。因此，在肠消化阶段，酸奶的补Ca效果也优于纯牛奶。

3 结 论

1）试验采用体外全仿生消化技术模拟纯牛奶和酸奶在人体胃、肠的消化过程，通过0.45 μm微孔滤膜和D101大孔树脂实现不同形态Ca的分离。

2）分别以正辛醇和单层脂质体模拟细胞膜，建立正辛醇吸收模型和单层脂质体吸收模型，模拟纯牛奶和酸奶中Ca在人体胃、肠中的吸收。

3）使用微波消解-HR-CS FAAS测定纯牛奶和酸奶中Ca分别为12.894和15.920 mg/g，酸奶中Ca质量分数高于纯牛奶。在酸奶胃、肠全仿生提取液中可溶态Ca、有机态Ca、正辛醇醇溶态Ca和单层脂质体结合态Ca的质量分数和所占总量百分比都高于纯牛奶，KOW值、DMW值和生物可给性也高于纯牛奶，表明酸奶的补Ca效果优于纯牛奶。

[1] 宋慧，陈尚龙，李超，等. 火焰原子吸收光谱法测定牛奶中不同化学形态的钙[J]. 食品科学，2012，33(22)：278－281.Song Hui, Chen Shanglong, Li Chao, et al. Speciation analysis of calcium in milk by flame atomic absorption spectrophotometry[J]. Food Science, 2012, 33(22): 278－281.(in Chinese with English abstract)

[2] Pohl P, Stecka H, Jamroz P. Solid phase extraction with flame atomic absorption spectrometry for determination of traces of Ca, K, Mg and Na in quality control of white sugar[J]. Food Chemistry, 2012, 130(2):441－446.

[3] 姜波，姜国斌，刘长建，等. 微波消解-AAS法分析银杏叶中金属元素[J]. 光谱学与光谱分析，2010，30(3)：812－815.Jiang Bo, Jiang Guobin, Liu Changjian, et al. Determination of metals inginkgo bilobaleaves by atomic absorption spectrometry with microwave digestion[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2010, 30(3): 812－815. (in Chinese with English abstract)

[4] Pohl P, Stelmach E, Szymczychamadeja A. Simplified sample treatment for the determination of total concentrations and chemical fractionation forms of Ca, Fe, Mg and Mn in soluble coffees[J]. Food Chemistry, 2014, 163(20): 31－36.

[5] Mao G H, Ren Y, Li Q, et al. Anti-tumor and immunomodulatory activity of selenium (Se) -polysaccharide from Se-enriched grifola frondosa[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 82(1): 607－613.

[6] Barbosa U A, Peña-Vazquez E, Barciela-Alonso M C, et al.Simultaneous determination and speciation analysis of arsenic and chromium in iron supplements used for iron-deficiency anemia treatment by HPLC-ICP-MS[J]. Talanta, 2017,170(8): 523－529.

[7] Mahn A, Zamorano M, Barrientos H, et al. Optimization of a process to obtain selenium-enriched freeze-dried broccoli with high antioxidant properties[J]. LWT-Food Science and Technology, 2012, 47(2): 267－273.

[8] Dong J Z, Ding J, Yu P Z, et al. Composition and distribution of the main active components in selenium-enriched fruit bodies of cordyceps militaris, link[J]. Food Chemistry, 2013,137(1-4): 164－167.

[9] Zhang B, Zhou K, Zhang J, et al. Accumulation and species distribution of selenium in Se-enriched bacterial cells of the bifidobacterium animals[J]. Food Chemistry, 2009, 115(2):727－734.

[10] Li X, Xing M, Chen M, et al. Effects of selenium-lead interaction on the gene expression of inflammatory factors and selenoproteins in chicken neutrophils[J]. Ecotoxicology& Environmental Safety, 2017, 139(5): 447－453.

[11] 韩克光，甄守艳，范华，等. 钙螯合羊骨胶原多肽的制备及表征分析[J]. 农业工程学报，2015，31(21)：301－307.Han Keguang, Zhen Shouyan, Fan Hua, et al. Preparation and characteristic analysis of calcium-chelated ossein peptide[J].Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE), 2015, 31(21): 301－307. (in Chinese with English abstract)

[12] Wu P, Bhattarai R R, Dhital S, et al. Invitro, digestion of pectin- and mango-enriched diets using a dynamic rat stomach-duodenum model[J]. Journal of Food Engineering,2017, 202(6): 65－78.

[13] Sun L, Liu G, Yang M, et al. Bioaccessibility of cadmium in fresh and cooked Agaricus blazei, Murill assessed by in vitro,biomimetic digestion system[J]. Food & Chemical Toxicology,2012, 50(5): 1729－1733.

[14] Li S X, Lin L X, Zheng F Y, et al. Metal bioavailability and risk assessment from edible brown alga Laminaria japonica,using biomimetic digestion and absorption system and determination by ICP-MS[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2011, 59(3): 822－828.

[15] Lalanne M, Khoury H, Deroussent A, et al. Metabolism evaluation of biomimetic prodrugs by in vitro, models and mass spectrometry[J]. Int J Pharm, 2009, 379(2): 235－243.

[16] Wagh P, Parungao G, Viola R E, et al. A new technique to fabricate high-performance biologically inspired membranes for water treatment[J]. Separation & Purification Technology,2015, 156(2): 754－765.

[17] Szcześ A, Jurak M, Chibowski E. Stability of binary model membranes--prediction of the liposome stability by the langmuir monolayer study[J]. Journal of Colloid & Interface Science, 2012, 372(1): 212－218.

[18] 林路秀，李顺兴，郑凤英. 应用体外仿生模型分析海藻水煎液中微量金属的形态和生物可给性[J]. 分析化学，2010，38(6)：823－827.Lin Luxiu, Li Shunxing, Zheng Fengying. Application of in vitro bionicsm odels for speciation analysis and bioavailability assessment of trace metals in marine algal soup[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2010, 38(6): 823－827. (in Chinese with English abstract)

[19] Nobre T M, Pavinatto F J, Caseli L, et al. Interactions of bioactive molecules & nanomaterials with Langmuir monolayers as cell membrane models[J]. Thin Solid Films, 2015, 593(10):158－188.

[20] Peronico V C D, Raposo J L. Ultrasound-assisted extraction for the determination of Cu, Mn, Ca, and Mg in alternative oilseed crops using flame atomic absorption spectrometry[J].Food Chemistry, 2016, 196(4): 1287－1292.

[21] Ozbek N, Baysal A. A new approach for the determination of sulphur in food samples by high-resolution continuum source flame atomic absorption spectrometer[J]. Food Chemistry,2015, 168(2): 460－463.

[22] Paz-rodríguez B, Aboal-somoza M, Bermejo-barrera P.Application of high resolution-continuum source flame atomic absorption spectrometry (HR-CS FAAS): determination of trace elements in tea and tisanes[J]. Food Chemistry, 2015,170(3): 492－500.

[23] Baysal A, Akman S. A practical method for the determination of sulphur in coal samples by high-resolution continuum source flame atomic absorption spectrometry[J]. Talanta, 2011, 85(5):2662－2665.

[24] Brandao G C, Jesus R M D, Silva E G P D, et al. Use of slurry sampling for the direct determination of zinc in yogurt by high resolution-continuum source flame atomic absorption spectrometry[J]. Talanta, 2010, 81(4-5): 1357－1359.

[25] Gómez-Nieto B, Gismera M J, Sevilla M T, et al. Fast sequential multi-element determination of major and minor elements in environmental samples and drinking waters by high-resolution continuum source flame atomic absorption spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2015(1), 854: 13－19.

[26] Kowalewska Z, Laskowska H, Gzylewski M. Application of high-resolution continuum source flame atomic absorption spectrometry to reveal, evaluate and overcome certain spectral effects in Pb determination of unleaded gasoline[J].Spectrochimica Acta Part B Atomic Spectroscopy, 2017,132(6): 26－36.

[27] 张建萍，陈尚龙，刘恩岐，等. 微波消解-HR-CS AAS法测定几种调味品中的微量元素[J]. 现代食品科技，2013，29(6)：1424－1427.Zhang Jianping, Chen Shanglong, Liu Enqi, et al. Determination of trace elements in some seasonings by microwave digestion-high resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrophotometry[J]. Modern Food Science and Technology, 2013, 29(6): 1424－1427. (in Chinese with English abstract)

[28] 陈安徽，陈尚龙，巫永华，等. 黄精酵素口服液中钙、铁和锌的形态分析[J]. 现代食品科技，2016(1)：272－277.Chen Anhui, Chen Shanglong, Wu Yonghua, et al. Speciation analysis of calcium, iron, and zinc in the oral liquid including polygonatum and enzymes[J]. Modern Food Science and Technology, 2016(1): 272－277. (in Chinese with English abstract)

[29] Oomen A G, Rompelberg C J, Bruil M A, et al. Development of an in vitro digestion model for estimating the bioaccessibility of soil contaminants[J]. Archives of Environmental Contamination& Toxicology, 2003, 44(3): 281－287.

[30] 李勇，陈尚龙，王书兰，等. 饮料酒中 Cd的测定方法研究[J]. 徐州工程学院学报(自然科学版)，2012，27(4)：16－19.Li Yong, Chen Shanglong, Wang Shulan, et al. Study on determination methods of cadmium content in alco-holic drink[J]. Journal of Xuzhou Institute of Technology(Natural Sciences Edition), 2012, 27(4): 16－19. (in Chinese with English abstract)