SSR分子标记检测杂交稻种纯度的技术改良

， , 勤坚,

(广东省农业科学院农业生物基因研究中心，广州 510640)

纯度是指品种在特征特性方面典型一致的程度，用该品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示[1]。种子纯度是种子质量好坏的衡量标准之一，对种子纯度检测是防止良种混杂退化、提高种子质量和产品品质的必要手段[2]。目前检测种子纯度的方法有很多种，公认最直观准确和最具权威性的种子纯度检测方法为田间小区种植鉴定，一般需要一个生长季节才能取得结果，受季节和时间限制，严重滞后于农业生产用种进程[3]。较多学者通过与田间种植鉴定结果比较分析发现，利用SSR分子标记技术能准确鉴定杂交水稻种子纯度[4-7]。当前，SSR分子标记技术已广泛应用于杂交水稻种子纯度检测，并成为国家标准，但利用SSR分子技术还存在一些限制因素。詹庆才[8]课题组采用该方法为500家种子企业的20 000多份样本进行检测，大多数结果与大田结果相吻合，但在检测中发现，有的样品采用不同的SSR引物检测时结果出现很大的差异。除此之外，在利用SSR分子标记检测杂交稻种纯度时还存在样本量不统一且尚未做规定的问题[9-10]。因此本研究对这方面进行初步探讨，以期能作为以后纯度检测工作的参考。同时也研究了如何从技术层面优化DNA提取方法和如何结合SSR分子标记的多态性从电泳技术上降低检测成本，提高检测效率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为杂交稻品种博优998、天优998、秋优998、Ⅱ优122和博优368以及天丰优3550均由广东金稻种业提供。

图1 SSR标记RM 208对博优368的杂株鉴定(3层样品)

1.2 基因组DNA提取方法

DNA提取采用TPS法，具体如下：取单粒种子(去颖壳)或种子发芽7 d后取单颗幼苗叶片1～2 cm置于2 mL的离心管中，加1 000μL的TPS抽提液(100 mmol/L pH=8.0 Tris-HCl和10 mmol/L EDTA以及1 mol/L KCl)，放入小钢珠，于组织磨样机磨样约5 min；取出小钢珠后，将磨碎的样品于75 ℃水浴箱中水浴40 min；13 000 r/min离心10 min；取约500μL上清液于1.5 mL的离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀，在-20 ℃冰箱中放置0.5 h，直到DNA析出；13 000 r/min离心3～5 min；弃上清，取沉淀，用70%乙醇漂洗，适当风干后加200～300μL灭菌的1×TE(10 mmol/L Tris-HCl pH=8.0，0.1 mmol/L EDTA)溶液溶解。

1.3 SSR扩增

利用NY/T 1433-2014[7]提供的48对SSR分子标记对材料亲本进行多态性筛选。引物由华大基因合成。PCR反应体系：利用96孔PCR板，每孔的样品成分包括dNTP(10 mmol/L)0.2μL、10×PCR buffer(含15 mmol/L MgCl2)2.0μL、引物F(2μmol/L)1.5μL、引物R(2μmol/L)1.5μL、Taq酶(5 U/μL)0.1μL、ddH2O 12.6μL、DNA 2μL；每个样混匀后根据以下程序进行整板SSR反应：94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s(35个循环),72 ℃ 45 s;72 ℃ 5 min。

1.4 电 泳

6%聚丙烯酰胺电泳：配胶制胶；每20μL体系加入4μL载样缓冲液，混匀，取3～4μL注入点样孔(同块胶上样2～3次，每层样品上样间隔一定的时间)；利用北京君意的JY-JX 5 L电泳设备进行300 V电泳3 h；银染后显带，分析电泳结果。

1.5 统计分析

本试验采用无重复双因素方差分析方法分析数据的差异性。

2 结果与分析

2.1 糙米和叶片DNA提取的比较

从表1可以看出，采用TPS法都能提取水稻糙米和叶片的DNA，用于SSR扩增电泳。利用叶片提取DNA的成功率为92.34%，比利用糙米提取DNA要高34.21%，达到显著水平(p=0.018)，表明不同类型材料采用同种方法提取DNA的成功率差异明显，即不同类型材料会影响DNA提取的成功率。另外，同一类型材料的不同品种之间并无显著差异，如利用糙米提取的4个品种之间的差异不显著(p=0.09)，利用叶片提取的4个品种之间的差异不显著(p=0.95)，表明DNA的提取成功率与品种类型无关。

表1 采用TPS法提取糙米和叶片DNA用于SSR扩增的成功率

注：表中数据为3个重复平均值±标准误,每个重复为264个样品。

2.2 SSR多态标记多层上样比较

本试验从48对SSR标记中筛选出13对标记在6个品种的9个亲本之间都有多态性。本试验挑选了多态性较明显的RM 208、RM 481和RM 490标记进行检测。图1和图2分别为标记RM 208、RM 481多层上样后银染的结果，由于这2个标记带型单一，覆盖范围不大，能进行2～3层上样。从图1和图2可见，杂株的带型均能清楚地显示，并且不同层之间能够明显区分。通过图1与图2比较发现，标记RM 208带型的覆盖范围较RM 481的小，因此可以比RM 481的多上一层的样。

2.3 不同样本量纯度检测结果的比较与分析

图2 SSR标记RM 481对天丰优3550的杂株鉴定(2层样品)

表2 检测不同样本量杂交稻博优368的种子纯度

表3 检测不同样本量杂交稻天丰优3550的种子纯度

3 讨 论

利用TPS法可以提取糙米DNA，虽然叶片可以快速便捷地提取DNA，但是前期需要至少7 d的发芽时间，因此相对延长了纯度检测时间，使用糙米提取DNA可以解决这个问题。尽管DNA提取成功率有待提高，但TPS法有较多的优势：所使用的试剂对人类健康不会造成伤害，成本低廉；同时，多年的实践发现，该法提取的DNA稳定性好，在常温下可以保持2年以上；重复性强，在不同的实验环境都能提取出用于SSR扩增的DNA；TPS法操作简单，提取时间短，每人每天可以提取400个样。而相比其他快速提取方法，存在重复性差的问题，笔者曾多次利用快速提取方法[17-18]都得不到理想的提取效果。而CTAB法虽然能高质量提取种子DNA，但是操作繁琐，不适用于SSR标记检测种子纯度。

本试验从13对多态引物筛选出3对进行SSR扩增，挑选3对标记带型较简单，可以进行多层上样，即不同层样品间隔一定的时间再上样，这意味着在相同的电泳条件下，由于相同标记扩增的片段长度一致，电泳速度一致，因此同泳道上不同时间点样的样品便可以区分开。从图1和图2可以看出，这主要依赖于多态性标记的筛选，筛选出比较单一好用的标记能将检测效率大大提高。李立群等[19]通过改进SSR标记变性PAGE试验方法及引物筛选发现，只要扩增条带特异性强覆盖范围不大的差异引物均可组合采用2次点样法，降低了50%的试验成本，节约41%的试验时间。而本试验也利用了北京君意的JY-JX 5 L电泳槽进行同标记的3层上样，增加了2倍的效率，这样既能提高电泳效率也可以降低物品消耗。

在样本容量方面，NY/T 1433-2007及2014[20]都没有提及种子纯度鉴定样本容量，而GB/T 3543.5—1995[1]对这方面规定得比较详细：种子鉴定需400粒，田间小区种植鉴定需根据公式(N-1)×100%/N计算种植株数4N，聚丙烯酰胺电泳法测定大麦、小麦种子纯度时每个样本测定100粒。李青丰[21]等通过统计学方法分析认为，用电泳法进行品种鉴定时100粒种子的样本数量太小。郭承亮[22]则认为，选取1 000粒甚至2 000粒做检测效果较好，但这无疑增加各个环节的工作量，不利于效率提高。苏顺宗[23]利用SSR标记检测杂交稻种子纯度时每个样选取了200粒，结果与田间纯度无显著差异。李召华[9]则认为，样品检测200～300粒可保证检测结果的可靠性。本试验通过不同样本量并结合公式则认为，192～288为合适的检测样本量，这与目前大部分学者的建议量吻合。

[1]中华人民共和国国家标准.农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定.GB/T 3543.5—1995:54.

[2]吴秋华,张春娇,张宝顺.玉米种子纯度鉴定技术概述[J].种子世界,2014(12):16-19.

[3]赖元洪.杂交水稻种子真实性与纯度鉴定[J].中国种业,2015(6):19-21.

[4]谭智丹,余显权,高健强,等.利用SSR鉴定杂交水稻种子纯度的研究[J].种子,2006,25(4):27-33.

[5]殷兆晴,王玉平,周黎军,等.杂交水稻种子纯度的SSR分子检测及应用研究[J].西南农业学报,2006,19(6):1 000-1 004.

[6]朱玉君,毛一剑,李春生,等.利用SSR标记鉴定杂交水稻种子纯度[J].中国稻米,2009(6):24-26.

[7]周会,苏秀,毛双林,等.杂交水稻品种真实性和纯度的SSR分子标记鉴定[J].种子世界,2014,3(18):34-35.

[8]朱国奇,陈静萍,詹袆捷,等.不同引物鉴定同一杂交水稻种子样品纯度结果的差异及及原因分析[J].杂交水稻,2015,30(3):81-84.

[9]李召华,朱克永,陈祖武,等.SSR分子标记技术在杂交水稻种子纯度鉴定中的应用[J].杂交水稻.2006,21(4):11-14.

[10]张安宁,王加红,余新桥,等.SSR标记在杂交稻纯度鉴定中的应用[J].上海农业学报,2013,29(6):53-55.

[11]杜子芳.抽样技术(第四版)[M].北京:中国统计出版社,2015.

[12]孙山泽.抽样调查[M].北京:北京大学出版社,2004.

[13]倪家勋主译,孙山泽校译.抽样调查[M].北京:中国统计出版社,1997.

[14]冯士雍,倪加勋,邹国华.抽样调查原理与方法[M].北京:中国统计出版社,1998.

[15]冯士雍．抽样调查理论与方法[M].北京:中国统计出版社,1999:24.

[16]金勇进,蒋妍,李序颖.抽样技术[M].北京:中国人民大学出版社,2002.

[17]王婧,杨洁,丁华,等.适用于SSR-PCR试验的水稻基因组DNA提取方法的比较[J].湖北农业科学,2012,51(24):5 794-5 797.

[18]陈文岳,韩利红,宋亮.用于PCR分析的水稻DNA简易提取法——CS法[J].杭州农业科技,2004(2):5-7.

[19]李立群,王培,王小利,等.SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法改进[J].安徽农业科学,2012,40(34):16 541-16 544.

[20]中华人民共和国农业行业标准.水稻品种鉴定技术规程SSR标记法.NY/T 1433—2014:9-13.

[21]李青丰,房丽宁,董永平.用电泳法进行品种纯度鉴定中的统计学问题[J].种子,1995,14(4):39-40.

[22]郭承亮.SSR分子标记在杂交稻种子纯度精确鉴定中的应用[J].中国种业,2014(1):21-23.

[23]苏顺宗,黄玉碧,杨俊品,等.利用SSR鉴定水稻杂交种子纯度的研究[J].种子,2003,22(1):23-25.