全自动凯氏定氮仪测定蛋白饮料中蛋白质的不确定度分析

唐 静，罗 玥，黄 萍，蒋丽娜

(四川省食品药品检验检测院，四川成都 610100)

蛋白质含量是食品营养成分的重要指标之一，其检测质量直接影响对产品品质的评价。对测定结果不确定度的评定已成为通过中国实验室国家认可委员会的必要条件之一。蛋白饮料是目前消费者喜爱的饮料，有些消费者甚至想通过饮用蛋白饮料来补充蛋白质，因此，对于蛋白饮料中蛋白质含量的不确定度分析是很有必要的，它有助于消费者对蛋白饮料的正确认识以及选购。有关蛋白质测定不确定度评定的研究报道较多[1-2]，目前也有一些用自动定氮仪测定蛋白质的不确定度评定的报道[3-5]，但是用全自动凯氏定氮仪测定蛋白饮料中蛋白质的不确定度分析鲜有报道。该研究依据JJF1059—1999《测量不确定度评价与表示》[6]建立了以核桃花生奶为试验对象的不确定度评定方法，识别出测定过程中的关键环节，重点关注关键环节的质量控制，以期有效地提高检测工作的质量，为消费者提供可靠的营养指标参数。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1样品。试验对象为核桃花生奶，为国家抽检样品。

1.1.2试剂。浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜、硼酸、氢氧化钠、甲基红、溴甲酚绿、95%乙醇，均为分析纯。盐酸标准溶液(0.1 mol/L)，根据GB/T 601—2016《化学试剂标准滴定溶液的制备》[7]配制、标定而成。

1.1.3仪器。8400型全自动凯氏定氮仪、消化炉均为丹麦FOSS公司所生产；电子分析天平；滴定管50 mL，A级。

1.2方法

1.2.1方法原理。检测方法参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[8]。核桃花生奶与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解的氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再以盐酸标准溶液滴定，根据盐酸消耗量计算蛋白质含量。

1.2.2试样处理。称取10～20 g试样，至于消化管中，加催化剂和16 mL浓硫酸，于8400型全自动凯氏定氮仪的消化炉中集中加热，采取梯度缓慢升温的方式。消化完全后，取下消化管，冷却至室温，按照仪器说明书进行蒸馏测定。根据所消耗的盐酸标准溶液的体积，求出蛋白质含量。

1.2.3建立数学模型。蛋白质含量计算公式如下：

(1)

式中，X为试样中蛋白质含量(%)；V1为试样消耗盐酸标准溶液的体积(mL)；V0为空白消耗盐酸标准溶液的体积(mL)；C为盐酸标准溶液浓度(mol/L)；m为试样质量(g)；0.014 0为每毫摩尔质量氮的克数；F为氮换算成蛋白质的系数，此处蛋白饮料为6.25。

由于各分量相互独立，得出X的相对合成标准不确定传播率为

(2)

式中，ur(rep)为平行重复试验的相对扩展标准不确定度。

2 结果与分析

2.1测定不确定度的来源及计算

2.1.1检测过程重复性的不确定度。表1为测定花生核桃乳中蛋白质的8次平行试验结果，测定覆盖该方法的全过程，即称量、消化、自动蒸馏和滴定。

表1 蛋白质测定结果

ur(rep)=0.004 49

2.1.2全自动凯氏定氮仪自动滴定引入的不确定度。根据全自动凯氏定氮仪检定证书提供，仪器扩展不确定度U仪器=1.4%,k=2，ur(仪器)=u仪器/kc=0.005 38。

2.1.3样品称量所用的电子天平示值引入的不确定度。经查天平校准证书，称量样品的电子天平最大允许误差为±0.5 mg，重复性误差为1.5 mg，四角误差为±1.0 mg，按正态分布考虑，k=3，称样量的平均值为10.902 0 g，则合成标准不确定度为u(m)=0.726 5 mg，ur(m)=u(m)/m=0.000 066 6。

2.1.5盐酸标准溶液浓度的不确定度。根据GB/T 601—2016进行盐酸标准溶液的配制及标定，其数学模型为

式中,CHCl为盐酸标准溶液浓度(mol/L);PNa2CO3为无水碳酸钠的纯度(%)；VHCl为滴定消耗的盐酸体积(mL)；MNa2CO3为无水碳酸钠的摩尔质量(g/mol)。

不确定度传播率为

ur(X)=

式中，rep为平行重复标定的总重复性因子。

2.1.5.1标定重复性引入的不确定度。表2为8次重复标定的结果，按A类评定。

ur(rep)=0.000 400

表2 盐酸标定结果

2.1.5.2无水碳酸钠基准物质纯度引入的不确定度。供应商给出无水碳酸钠基准物质纯度P=99.98%，不确定度优于0.05%，按B类评定正态分布，不确定度为u(PNa2CO3)=0.011 5%，ur(PNa2CO3)=u(PNa2CO3)/P=0.000 115。

2.1.5.3称量无水碳酸钠引入的不确定度ur(mNa2CO3)。经查电子天平的校准证书，该天平最大允许误差为±0.5 mg，重复性误差为1.5 mg，四角误差为±1.0 mg，按正态分布考虑，k=3，称样量的平均值为0.201 32 g，则合成标准不确定度为u(mNa2CO3)=0.623 6 mg，ur(mNa2CO3)=u(mNa2CO3)/mNa2CO3=0.003 10。

2.1.5.4无水碳酸钠摩尔质量M数值引入的不确定度。从最新的IUPAC原子量表，查得无水碳酸钠各组成元素的原子量及其不确定度见表3。

表3无水碳酸钠各组成元素的原子量及其不确定度

Table3Theatomicweightanduncertaintyofeachcomponentofanhydroussodiumcarbonate

组成元素Element原子量Atomicweightg/mol不确定度Uncertainty标准不确定度Standarduncertaintyg/molNa22．9898±0．00010．000060C12．0107±0．00080．000460O15．9994±0．00030．000170

u(MNa2CO3)=0.000 670 mg

MNa2CO3=105.988 5 g/mol

ur(MNa2CO3)=u(MNa2CO3)/MNa2CO3=0.000 006 30

2.1.5.5滴定基准物质消耗盐酸标准溶液体积引入的不确定度。

(3)2种分量合成。u(VHCl)=0.030 0 mL，ur(VHCl)=0.000 828 mL。

2.1.5.6盐酸标准溶液浓度合成标准不确定度。ur(CHCl)=0.003 24。

2.2合成不确定度分量的计算及分析由上述可得到计算蛋白质含量不确定度的有关量值。

根据公式(2)得到X的相对合成标准不确定度为ur(X)=0.008 03，u(X)=0.010 4%。

对各影响蛋白质含量的测定因素的分量进行分析，从表4可以看出，仪器自动滴定的体积对测定结果影响最大，占分量总和的34.94%，是影响测定结果不确定度来源的主要分量。其次是重复性试验、盐酸标准溶液的浓度以及数字修约的影响，样品称量所引入的不确定度是最弱小的，可以忽略不计。

表4 合成标准不确定度分量的分析

2.3扩展不确定度取包含因子k=2(置信概率95%)，则U=2×u(X)=0.020 8%，蛋白质含量为(1.30±0.03)%。

3 结论与讨论

(1)影响样品测定结果的不确定度分量很多，此次采用全自动凯氏定氮仪测定核桃花生奶中蛋白质含量，其测量不确定度主要来源于仪器自动滴定体积的不确定度，其次是检测过程重复性试验的不确定度，即随机效应导致的不确定度、盐酸标准溶液浓度的不确定度以及数字修约引入的不确定度。因此，仪器的先进性成为减小合成不确定度的主要因素。

(2)从检测过程重复性的不确定度即随机效应导致的不确定度部分可以看出：重复性产生的不确定度主要来源于样品的称量、消化及自动蒸馏、滴定全过程的重复性试验，综合上述的各分量所占比重，得出为减少重复性检测所产生的不确定度，需要特别注意样品消化、自动蒸馏、滴定的过程。

(3)从盐酸标准溶液浓度的不确定度可以看出：主要来源于盐酸标定过程中滴定体积引入的不确定度，因此要特别注意在滴定过程中，准确判定终点，以减少因此产生的不确定度。

[1] 黄奕娜，侯晓东，张树潮，等.乳粉中蛋白质含量测定结果的不确定度评定[J].食品研究与开发,2008,29(10)：98-100.

[2] 姜诚，沙祎炜.婴幼儿奶粉中蛋白质测定的不确定度的评定[J].乳业科学与技术,2008(3)：123-125.

[3] 程树维，顾金玲，逄晶.自动凯氏定氮仪测定大豆中蛋白质含量的不确定度评定[J].食品科技,2007(5):231-233.

[4] 潘葳，宋永康，黄星.自动凯氏定氮仪测定灵芝中蛋白质的不确定度评定[J].现代科学仪器,2009(2)：92-95.

[5] 徐志飞，李芳.凯氏定氮法测定蛋白粉中蛋白质含量的不确定度分析[J].中国卫生工程学,2015,14(4):361-362，365.

[6] 国家质量技术监督局.测量不确定度评定与表示：JJF 1059—1999[S].北京：中国计量出版社,1999:7-10.

[7] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.化学试剂 标准滴定溶液的制备：GB/T 601—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[8] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品中蛋白质的测定：GB 5009.5—2016[S].北京：中国标准出版社，2017.