甘草酸对光老化HaCaT细胞的保护作用及炎症因子影响

张丽宏，傅云，王业秋，廖建，张艳红，李建民*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.资阳川中医院，四川 资阳 641300)

近几年，工业化生产日益增加，臭氧层遭到严重破坏，皮肤伤害也逐渐增加，主要表现为红斑、皱缩、粗糙、无光泽，严重可导致肿瘤发生[1]。随着人们对美容的重视，皮肤光老化越来越引起人们关注，探索中药预防及治疗皮肤光老化已成当今研究热点。

甘草为豆科甘草属植物的根和根茎，甘草酸是甘草根部提取物中含量较高的重要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗变态反应、调节免疫、抑制黑色素沉着、抗癌等作用[2-3]。甘草酸具有较好的光热稳定性，可修复UV辐射导致的皮肤炎症[4]。目前，对有效成分甘草酸抗皮肤光老化的机制研究尚不明确，本实验采用30 mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，建立光老化模型，用不同浓度甘草酸作用于光老化HaCaT细胞，探讨甘草酸对光老化HaCaT细胞的保护作用及机制。

1 实验材料和仪器

1.1 实验材料

人皮肤角质形成细胞 HaCaT(中乔新舟)；胎牛血清 FBS(Hyclone 公司，批号NYB0614)；DMEM 培养液(Hyclone 公司，批号NZM1301)；双抗(Hyclone 公司，批号20161230)；磷酸盐缓冲液 PBS(北京中山金桥有限公司，批号20160509)；胰蛋白酶(Billab 公司，批号J120028)；四甲基噻唑蓝 MTT(Sigma 公司，批号021005)；二甲基亚砜 DMSO(天津市富宇精细化工有限公司，批号20160716)；SOD 试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20170522)；GSH 试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20170518)；CAT 试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20170523)；RIPA细胞裂解液及 PMSF 蛋白酶抑制剂(碧云天生物技术研究所)；兔抗人β-actin 单克隆抗体(博奥森生物有限公司)；兔抗人IL-1β、IL-6、TNF-α多克隆抗体(博奥森生物有限公司)；羊抗兔二抗(博士德生物有限公司)；甘草酸标准品(成都曼思特，批号MUST-16081812)。

1.2 实验仪器

生物洁净工作台(BCM-1000A 型)；苏州安泰空气技术有限公司；CO2培养箱(HF240型)；上海力申科学仪器有限公司；Olympus 倒置显微镜(IX-71-21PH 型,日本Olympus 株式会社)；酶标仪(MK3 型，上海热电仪器有限公司)；高速台式冷冻离心机(ETR16-2型，上海安亭科学仪器厂)；DYY-10C 型电泳仪(北京六一仪器厂)；Smart chemi Ⅱ型一体式微型化学发光成像仪(北京赛智创业有限公司)。

2 实验方法

2.1 10%DMEM培养液的配制

DMEM培养基：FBS：P/S=89:10:1，混匀，4℃保存。

2.2 药物配制

通过预实验确定甘草酸浓度大于10-5mol/L时对HaCaT细胞产生毒性，本实验将甘草酸加入DMEM培养液中，配制成10-3mol/L的药物母液，在实验需要时将母液稀释成10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L 三个浓度，调pH值至7.0，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。

2.3 细胞培养

细胞生长至对数期，胰酶消化，离心，并使用计数板计数，以1×104个/孔将细胞接种至96孔板，每组6个复孔，以1×106个/孔将细胞接种至6孔板，于37℃，5%CO2培养箱培养。

2.4 MTT法检测甘草酸对光老化HaCaT增殖率影响

96孔板内细胞随机分为空白组，模型组，10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L甘草酸组。细胞培养24 h后，吸弃培养液，PBS洗2次，每孔加200 μL PBS，使用铝箔纸将空白组覆盖，用30 mJ/cm2UVB照射模型组和甘草酸组，照射完毕，弃去PBS，甘草酸组加入不同梯度浓度的甘草酸，模型组和空白组加入等量培养液，孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/ml)，孵育4 h，吸弃培养液，每孔加入150 μL DMSO，37℃恒温培养震荡器上震荡10 min，在酶标仪492 nm波长处测定吸光度值。

2.5 试剂盒检测HaCaT细胞中GSH、SOD及CAT活性

6孔板细胞参照“2.4”项下方式建立光老化模型。待细胞生长密度达80%～90%时，收集6孔板中各组细胞，PBS洗2次，RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF以99:1混匀，按照100 μL/孔加入混合液，冰盒上静置30 min，4℃，13 200 rpm的条件下离心15 min，在冰盒上收集上清液于离心管中，按照试剂盒说明书检测各组细胞中GSH、SOD及CAT活性。

2.6 Western Blot法检测HaCaT中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达量

收集6孔板中各组细胞，使用RIPA和PMSF混合液提取蛋白，BCA法测定各组细胞蛋白浓度，每孔加样20 μL，SDS-PAGE电泳60 min，半干转膜30 min，室温封闭2 h，加入一抗孵育，4℃过夜，TBST洗膜三次，加二抗室温孵育1 h，TBST洗膜三次，加入ECL显色，使用发光成像仪拍摄，利用Lane ID 凝胶软件分析各条带的灰度值，以目的条带灰度值和内参条带灰度值的比值，反映目的蛋白的表达水平。

2.7 统计学处理

3 结果

3.1 甘草酸对HaCaT细胞增殖率影响

见表1。与空白组相比，模型组细胞增殖率显著降低(P<0.01)；与模型组相比，10-7、10-6、10-5mol/L甘草酸组细胞增殖率显著升高(P<0.01)。

表1 甘草酸对HaCaT细胞增殖率影响

注：与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01

3.2 甘草酸对HaCaT细胞中SOD、GSH及CAT活性的影响

见表2。与空白组相比，模型组SOD、GSH、CAT 活性显著性降低(P<0.01)。与模型组相比，10-7、10-6、10-5mol/L甘草酸组SOD、GSH及CAT活性显著升高(P<0.01)，随着浓度的增大，SOD、GSH及CAT活性逐渐升高。由此可知，10-7、10-6、10-5mol/L的甘草酸对光老化HaCaT细胞具有较好的保护作用，且这种保护作用对甘草酸的浓度有一定的依耐性。

表2 甘草酸对HaCaT细胞中SOD、GSH及CAT活性的影响

注：与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01

3.3 甘草酸对HaCaT细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达量的影响

由表3和图1可知，与空白组相比，模型组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，10-7mol/L 甘草酸组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达量明显降低(P<0.05)，10-6、10-5mol/L甘草酸组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达量极显著降低(P<0.01)。

表3 甘草酸对HaCaT 细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达量的影响

注：与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01

图1 甘草酸对HaCaT细胞中IL-1β、IL-6、 TNF-α蛋白表达量的影响注：A：空白组；B：模型组；C：10-7 mol/L甘草酸组；D：10-6 mol/L甘草酸组；E：10-5 mol/L甘草酸组

4 讨论

角质形成细胞位于人体皮肤最表层，是UVB 辐射的主要靶细胞，长期的UVB辐射将导致皮肤光老化，甚至发生癌变[5-6]。TNF-α作为机体中广泛分布的关键促炎因子，具有介导炎症、免疫应答和凋亡等多种生物学效应[7-9]，可促进多种细胞炎症因子如 IL-1β，IL-6，IL-8 和 IL-12 等的合成[10-11]。在机体受到外界刺激时，IL-1β是具有免疫调节和执行宿主防御功能的炎症因子[12]，可以刺激角质形成细胞中表皮生长因子受体，诱导ERK途径的磷酸化，导致MMP-1的表达增加，从而加速胶原蛋白的降解，促进光老化的发生[13]。IL-6通过自分泌机制诱导MMP-1的表达，导致细胞外基质的降解，诱导皮肤光老化[14]。因此，IL-1β、IL-6以及TNF-α在UVB诱导角质细胞光老化的过程中起着至关重要的作用。

本实验研究结果显示，30 mJ/cm2UVB辐射角质形成细胞后，模型组SOD、GSH、CAT 活性降低，IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达量升高；而加入药物处理后，10-7、10-6、10-5mol/L甘草酸组SOD、GSH、CAT活性升高，IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达量降低。分析其原因，甘草酸可通过提高SOD、GSH及CAT活性，清除体内氧自由基，抑制脂质过氧化反应，与此同时，甘草酸还可通过减少炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的产生，抵抗UVB辐射对细胞造成的光损伤。

甘草酸作为我国传统中医药甘草中的一种天然药物活性成分，可保护紫外线对皮肤造成的光损伤，在日后防护紫外线产品的研究开发中具有重要参考价值，有望开发成为临床可用的新型抗皮肤光老化药物。

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