PI3K/Akt/eNOS信号通路调控人参皂苷素Rb1对急性心肌缺血大鼠心肌的作用

臧安缘，冷雪，李其芳

(辽宁中医药大学省部共建中医脏象理论及应用教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110847)

急性心肌缺血一直是威胁人类健康的常见心血管类疾病，如何有效的控制缺血是治疗的关键点。NO(nitric oxide, NO)是一种生物体内能使血管平滑肌舒张的内源性小分子物质，同时兼具保护血管内皮细胞生存和保护心肌的作用，作为生成NO的一氧化氮合成酶(endothelial NOS,eNOS)则起到了关键的作用[1-4]。很多研究证实,相关药物在治疗心肌缺血性损伤发生机制中NO及eNOS都有着一定的变化，同时NO的变化也与细胞凋亡机制有关[4-6]。同时现已证实,PI3K/Akt在血管形成上的重要作用，他可以磷酸化后激活eNOS生成NO，AKT被认为是血管形成中的关键因子[7]。课题组前期研究表明人参皂苷素Rb1具有保护心肌缺血的作用[8]，在此基础上利用异丙肾上腺素(ISO)复制急性心肌缺血模型，观察PI3K-AKT-eNOS信号通路在人参皂苷素Rb1减轻大鼠心肌缺血中的调控作用，进一步探讨心肌缺血的发生机制。

1 材料和方法

1.1 动物

清洁级SD大鼠，雄性，体质量180～200 g，由辽宁省本溪实验动物中心提供，许可证号：SCXK(辽)2013-0009。

1.2 主要试剂

人参皂苷素Rb1(成都普菲德生物技术有限公司，批号130-526)；ISO(Sigma公司，批号101443898)；NO ELISA试剂盒(基尔顿生物科技(上海)有限公司，批号DRE20010)；Real Time RT-PCR试剂盒(TaKaRa，批号DRR047A)，全部引物由 TaKaRa 公司合成，见表1。

PI3K、AKT、P-AKT(北京博奥森生物技术公司)；TBS缓冲液、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG等(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)(09D24C31、10B11B38、112586、112971)；FLPI2-MOOR激光散斑实时成像系统(英国moor公司)。

表1 引物序列

1.3 方法

1.3.1 急性心肌缺血大鼠模型的构建

取SD大鼠48只，雌雄不限，随机分为4组，每组12只，分别为空白对照组、模型组、人参皂苷素Rb1低剂量(10 mg/kg)组、人参皂苷素Rb1高剂量组(20 mg/kg)组。各组均腹腔注射给药(1 mL/100 g体质量)，空白对照组、模型组分别给予等量的生理盐水。连续给药5 d，每天1次。开始给药后的第4天和第5天，除空白对照组外，其余各组连续2次皮下多点注射给予ISO (30 mg/kg)，空白对照组给予等量生理盐水，给药体积均为1 mL/100 g体质量。

1.3.2 HE病理染色观察大鼠心肌形态变化

取大鼠各组心脏组织，4%多聚甲醛固定72 h，按苏木素-伊红(HE)染色常规方法进行，中性树胶封片石蜡包埋，光学显微镜下观察拍照。

1.3.3 MOOR激光血流微循环检测

每组末次给药10 min后，随机取5只，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定，麻醉后5 min，除空白对照组皮下给予等量生理盐水外，其余各组均皮下多点注射ISO，用MOOR激光散斑进行心脏表面微循环扫描，记录注射5 min后心脏表面30 s内的心脏血流情况。以MOOR心肌血流值作为心肌缺血指标。

1.3.4 NO含量检测

取各组其余的7只大鼠，给药30 min后， 经腹主动脉取血，放置20 min后3 000 r/min离心25 min，分离血清冷冻保存，按ELISA试剂盒说明检测NO的含量。

1.3.5 eNOS mRNA表达的测定

实验结束后取各组大鼠心肌组织，用RNAiso Plus试剂盒提取心肌组织总RNA，吸光度测定方法检测eNOS mRNA浓度和纯度。用ΔΔCT法对Real-time RT-PCR结果进行相对定量分析。

1.3.6 PI3K、AKT、P-AKT 蛋白表达的测定

实验结束后取各组大鼠心肌组织，称取100 mg放入玻璃匀浆器中，加入1 mL裂解液(蛋白裂解液与PMSF比例为100∶1)，在冰上充分研磨；吸入到预冷1.5 mL无菌EP管中；12 000 rpm，4 ℃，离心10 min，取上清；BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白变性后，每孔上样20 μL，电泳后转膜 3 h，一抗孵育 1 h 后，4℃ 过夜，次日二抗孵育1 h后，暗室中加入ECL发光液后，曝光 30 min，扫描图像后分析结果，目的蛋白与内参GAPDH条带的光密度比值后，再各组比较。

1.4 统计学处理

用SPSS19.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(Mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，F检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌形态变化

各组大鼠心肌组织行HE染色后，镜下可见，与空白对照组相比，模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，细胞间隙增大；人参皂苷素Rb1低剂量组和高剂量组均改善上述情况，高剂量组效果较显著。结果见图1。

图1 各组大鼠心肌形态(100×)注：A为空白对照组；B为模型组；C为人参皂苷素Rb1低剂量组；D为人参皂苷素Rb1高剂量组

2.2 各组大鼠心脏表面平均血流灌注量情况

与空白对照组相比，模型组心肌平均血流量显著降低(P<0.05)；给予人参皂苷素Rb1后，两组心肌血流量均显著增加(P<0.05)；与低剂量组Rb1组相比，高剂量组Rb1组心肌血流量增加较多(P<0.05)。结果见图2，表2。

图2 各组大鼠心肌平均血流量图注：A为空白对照组；B为模型组；C为人参皂苷素Rb1低剂量组；D为人参皂苷素Rb1高剂量组

组别n剂量(mg/kg)PU空白对照组5—546．98±5．06∗模型组5—354．73±31．69人参皂苷素Rb1低剂量组510412．33±51．82∗人参皂苷素Rb1高剂量组520483．03±79．42∗△

注：与模型组比较，*P<0.05；与人参皂苷素Rb1低剂量组比较，△P<0.05

2.3 各组大鼠血清NO含量比较

与空白对照组相比，模型组血清NO含量显著降低(P<0.05)；给予人参皂苷素Rb1后，两组血清NO含量均显著增加(P<0.05)；与低剂量组相比，高剂量组增加无显著差异性(P>0.05)。结果见表3。

表3 各组大鼠血清NO含量比较(Mean±SD)

注：与模型组比较，*P<0.05

2.4 各组大鼠心肌eNOS mRNA表达

与对照组相比，模型组心肌eNOS mRNA含量显著降低(P<0.05)；给予人参皂苷素Rb1后，两组心肌eNOS mRNA含量均显著增加(P<0.05)；与低剂量组相比，高剂量组增加无显著差异性(P>0.05)。结果见表4。

表4 各组大鼠心肌eNOS mRNA表达情况比较(Mean±SD)

注：与模型组比较，*P<0.05

2.5 PI3K、Akt、P-AKT蛋白表达情况比较

与空白对照组相比，模型组大鼠心肌组织PI3K蛋白表达及Akt蛋白磷酸化水平明显减低(P<0.01)；与模型组比较，高剂量组可以显著提高心肌组织PI3K蛋白表达及Akt蛋白磷酸化水平(P<0.01)，具有统计学意义。结果见图3。

图3 各组大鼠心肌组织PI3K及p-AKT蛋白的表达情况 注：与空白对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.05

3 讨论

人参一直是我国珍贵的中药材之一，因其独有的药理活性，被广泛应用于保护心脑血管、抗衰老等方面。人参皂苷素Rb1是人参中最重要的活性成分之一，现代研究证明其可以有效改善心脑血管系统功能，起到抗心肌细胞凋亡、保护心肌细胞的作用[9]。而细胞凋亡通路通常受PI3K-Akt-eNOS信号通路调控[10]，AKT通常磷酸化后被激活，磷酸化的AKT(P-AKT)可以通过磷酸化激活eNOS，eNOS是合成NO的关键限速酶，从而调控NO生成含量，NO在调控细胞凋亡的过程中起到了关键的作用，其可通过激活蛋白激酶C和线粒体ATP敏感性钾离子通道，改善线粒体功能，抑制线粒体释放凋亡因子，同时还具有扩张血管、清除氧自由基等重要生理功能，是抗冠状动脉粥样硬化等疾病的重要因子[11-12]。

本研究显示，模型组心肌结构紊乱，血流量明显降低(P<0.05)，表示心肌缺血模型造模成功，模型组血清NO含量以及心肌组织的eNOS mRNA 表达、PI3K、Akt、P-Akt蛋白表达显著降低(P<0.05)，给予低、高剂量皂苷素Rb1后，心肌结构得到改善，心肌血流量得到明显改善，且高剂量提高更显著；NO含量及eNOS mRNA 表达均显著高于模型组；PI3K、Akt、P-Akt蛋白表达增强。这可能是一定浓度的人参皂苷素Rb1对缺血心肌保护作用机制之一，通过结果可推测皂苷素Rb1具有一定的保护心肌作用。

PI3K-Akt-eNOS信号通路可通过调控Caspase-3、Bax、Bcl-2等下游通路来控制细胞凋亡[13]，本研究蛋白结果显示，心肌缺血后PI3K、AKT、P-AKT蛋白的表达降低，而给予低、高剂量的人参皂苷素Rb1后相应蛋白表达进一步上调，相比较低剂量组，高剂量组蛋白表达显著增强。其很有可能通过PI3K-AKT通路来促进eNOS mRNA表达，增加NO生成，达到抗心肌缺血保护心肌的作用。

相关报道称人参皂苷素Rg1在体外实验研究中可通过 PI3K/Akt 途径增加 VEGF的表达，通过 eNOS 途径增加 NO 的释放，从而诱导血管再生[14]，很可能皂苷素Rb1可通过PI3K-Akt- eNOS 途径增加NO的释放量来诱导心肌缺血血管的再生，其参与抗心肌缺血，抑制心肌细胞凋亡与自噬通路的作用还需要进一步研究。

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