双黄连口服液与颗粒剂微生物限度检查方法的研究

张乔，张琦，李静，姜德友，孟云阁

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨商业大学,黑龙江 哈尔滨 150076)

微生物限度检查是药品安全性研究的重要组成部分[1-3]，由于中药复方成分复杂，其中任何药材成分的抑菌作用都可能影响到微生物限度检查结果的准确性，因此通过方法学验证来确定所采用的微生物限度检查方法的可行性和有效性是十分有必要的[4-6]。本课题研究双黄连口服液与颗粒剂的微生物限度检查方法，以双黄连口服液和颗粒剂为研究对象分别进行常规倾注平皿法、培养基稀释法和薄膜过滤法三种微生物限度检查方法的比较，以期探究符合《中国药典》颁布的微生物限度检查的方法学验证来确保结果的准确性和可靠性[7-9]。此外，进行双黄连口服液与颗粒剂的微生物限度检查方法学适用性的研究，有助于对药品工业生产和微生物限度检查方法的检验检测以进一步的验证和补充。

1 实验材料

1.1 供试品

双黄连口服液(哈药集团三精制药有限公司，批号16120913、16121113、17012513；黑龙江省珍宝岛药业股份有限公司，批号B13170309217，黑龙江林宝药业有限责任公司，批号201704080；南阳市新生制药有限公司，批号20170562)。

双黄连颗粒剂(哈药集团中药二厂，批号160511、160171、160662；哈尔滨儿童制药厂有限公司，批号150703)。

1.2 菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]均由中国药品生物制品检定所提供。

1.3 培养基与试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基(北京陆桥技术有限公司，批号20170102)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(北京陆桥技术有限公司，批号20170102)。pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液(磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化钠、蛋白胨等)由中国药品生物制品检定所提供。

1.4 仪器

FB522型高压蒸汽灭菌器(连云港万云医疗器械股份有限公司)；BC102型台式封闭电炉(天津市泰斯特仪器有限公司)；AC323型生物安全柜(山东新华器械医疗股份有限公司)；FC502型恒温培养箱(杭州泰林生物技术设备有限公司)；FA102型一次性薄膜过滤器(杭州泰林生物技术设备有限公司)。

2 方法与结果

2.1 供试液的制备

将上述6个批次的黄连口服液分别抽取1 mL供试药液放入无菌试管中，量取9 mL pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液分别加入上述试管中，振荡器震荡，混匀，将试管依次编号，制成双黄连口服液供试液，待用。

将上述4个批次的黄连颗粒剂分别称取1.0 g供试品放入无菌试管中，量取9 mL pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液分别加入上述试管中，振荡器震荡至完全溶解，制成1∶10的黄连颗粒剂供试液，将试管依次编号，待用。

2.2 菌液的制备

抽取10 mL pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液加入到无菌试管中，制成多个平行试管缓冲液，依次排列并编号，斜面勾取第三代金黄色葡萄球菌的新鲜培养物于第一个试管中，在试管内侧壁碾碎溶解，振荡器振荡混匀制成最初的菌悬液，从第一个试管中吸取1 mL菌悬液加入第二个试管中，用移液管抽吸，混匀后，制成10-1稀释级的菌悬液，以此方法稀释，制成10-7稀释级的菌悬液，使每l mL溶液中含菌数约为50～100 cfu的菌液备用。

按上述菌液制备的方法同法制备枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌悬液。

2.3 回收率的测定

2.3.1 培养基平皿倾注常规法

用无菌移液管移取1 mL供试液和1 mL金黄色葡萄球菌的菌悬液注入无菌培养皿后，倾注15 mL胰酪大豆胨琼脂培养基于平皿中，分别做成10个平行样本的平皿；同法吸取1 mL枯草芽孢杆菌菌悬液和1 mL供试液加入无菌培养皿后，注入同一胰酪大豆胨琼脂培养基于平皿中，缓慢混匀培养皿内的培养基和溶液，待培养液凝固后，倒置放入以上两组平皿，放入培养箱中，35℃ 48 h培养，逐日点计菌落数,取平均值。上述同法制备白色念珠菌菌液与供试液，混合，注入后，并倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基于平皿中，在25℃的培养箱中倒置培养72 h，点计菌落数,取平均值。

2.3.2 培养基稀释法

用无菌移液管吸取1 mL供试液，分别置于5个无菌培养皿当中，每一个培养皿0.2 mL，然后在每一个平皿中注入金黄色葡萄球菌的菌悬液1 mL，而后倾注胰酪大豆胨琼脂培养基于平皿中；同法操作枯草芽孢杆菌，用无菌移液管吸取供试液1 mL平均置于5个胰酪大豆胨琼脂培养皿中，做法同上述培养液，每个平皿中注入移液管吸取的枯草芽孢菌悬液1 mL，混匀凝固后倒置放入35℃培养箱中培养48 h，逐日点计菌落数，取平均值。移液管吸取1 mL供试液平均分至于5个沙式葡萄糖琼脂培养基的平皿中，每个平皿中注入白色念珠菌菌悬液1 mL，做法同上述供试液，在25℃的培养箱中培养72 h，逐日点计菌数，取平均值。

2.3.3 薄膜过滤法

首先将滤膜进行冲洗润湿，抽取50 mL左右pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，通过一次性薄膜过滤器。用无菌注射器抽取1 mL供试液和1 mL枯草芽孢杆菌菌悬液，注入到一次性薄膜过滤器当中，加入100 mL pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液边进行抽滤，待薄膜过滤器中无液体后，取出薄膜，将薄膜菌面向上放置于事先制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基平皿中央，置于35℃的培养箱中培养48 h；同法做法操作薄膜放置于沙氏葡萄糖琼脂培养基平皿中，置于25℃的培养箱中培养72 h，逐日点计菌落数，取平均值。

对照组：按试验组的方法，不加菌悬液，只测定供试液的菌落总数。

菌液组：按上述方法测定加入的试验菌的菌落总数，不加入供试液。

根据实验结果数据分别计算平均值和回收率，见表1～3。

回收率(%)=(试验组菌数-对照组菌数)/菌液组菌数×100%

表1 双黄连口服液与颗粒剂常规法检测结果

表1中双黄连口服液常规法金黄色葡萄球菌回收率为22.95%，枯草芽孢杆菌回收率为10.35%，白色念珠菌回收率为28.96%；双黄连颗粒剂金黄色葡萄球菌回收率为22.63%，枯草芽孢杆菌为28.22%，白色念珠菌为33.86%。由常规法实验可知，双黄连口服液和双黄连颗粒剂均对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及白色念珠菌具有较强的抑制作用，由此可见，具有抑菌作用的中药复方的微生物限度检查，其抑菌作用将干扰到微生物限度检查的结果，常规法检查不能反映出药品被微生物污染的真实情况，须先去除样品中的抑菌活性，所以须进行培养基稀释法测定各菌群的验证试验[10-11]。

表2 双黄连口服液与颗粒剂培养基稀释法检测结果

表2中双黄连口服液培养基稀释法金黄色葡萄球菌回收率为83.91%，枯草芽孢杆菌回收率为73.37%，白色念珠菌回收率为57.50%；双黄连颗粒剂金黄色葡萄球菌回收率为78.57%，枯草芽孢杆菌回收率为57.21%，白色念珠菌回收率为68.55%。由培养基稀释法实验结果可知，双黄连口服液的供试液通过培养基稀释后，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用可基本消除，使其回收率达到70%以上；但是不能消除对白色念珠菌的抑制性，回收率仍低于70%；双黄连颗粒剂除对金黄色葡萄球菌的抑制作用被消除外白色念珠菌和枯草芽孢杆菌的回收率都低于70%，不符合微生物限度检查的方法学验证要求。

表3 双黄连口服液与颗粒剂薄膜过滤法检测结果

表3中双黄连口服液薄膜过滤法金黄色葡萄球菌回收率为87.09%，枯草芽孢杆菌回收率为81.73%，白色念珠菌回收率为85.86%；双黄连颗粒剂金黄色葡萄球菌回收率为88.71%，枯草芽孢杆菌回收率为84.03%，白色念珠菌回收率为92.19%。由薄膜过滤法实验结果可知，使用薄膜过滤法时，上述回收率均符合微生物限度检查的方法学验证，双黄连口服液和双黄连颗粒剂的抑菌活性均可被有效消除，各个试验菌株的回收率均达到70%以上，并且高于培养基稀释法的试验菌株回收率。

3 讨论

由表1～3可知,双黄连口服液符合2015年版《中国药典》中口服液体制剂的微生物限度标准，需氧菌总数不大于100 cfu/mL、霉菌总数不大于10 cfu/mL的要求，双黄连颗粒剂符合口服固体制剂、不含药材原粉的微生物限度标准，需氧菌总数不大于1 000 cfu/mL、霉菌总数不大于100 cfu/mL的要求[12]。

2015年版《中国药典》中规定，中成药制剂的微生物限度检查时，对于可能含有抑菌成分的供试品，必须采用相应检测方法消除其抑菌活性后，再进行相关的微生物限度检查。双黄连口服液和双黄连颗粒剂中含有黄芩、连翘、金银花等中药材，均具有较强的抑菌活性[13-14]。本次实验中平皿倾注常规法验证结果显示，其回收率均低于70%，表明本品使用常规法进行细菌和霉菌的微生物限度检查，受到供试品本身抑菌性的影响不能准确检测出供试品中所含的细菌数，影响到其检验结果的准确，需先去除该药品供试液的抑菌活性。运用培养基稀释法的回收率实验中，虽回收率有所升高但却不能完全达到方法学验证回收率为70%的要求，说明培养基稀释法仍不能完全消除供试液本身抑菌活性。

3种方法中只有采用薄膜过滤法处理后的供试液，其抑菌活性显示可能已被消除，CMCC系列菌株正常生长，菌株的回收率均超过70%，并且高于培养基稀释法和常规平皿倾注法。试验结果表明，薄膜过滤法消除供试品的抑菌活性效果最好，不影响实验菌株的生长，消除了供试品自身的抑菌活性，适合本药品微生物限度检查的检测要求，符合2015年版《中国药典》中的微生物限度检查方法学适用性实验的相关规定。

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