玉米sbe1和bt2基因SNPs位点的筛选

郭新梅，董 冰，葛兆鹏，裴玉贺，赵美爱，宋希云*

(1.青岛农业大学，山东 青岛 266019；2.青岛市主要农作物种质资源创新与应用重点实验室，山东 青岛 266019)

【研究意义】单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms SNPs)指在基因组水平上由单核苷酸的变异所引起的一种DNA 序列多态性，这种变异是由单碱基的转换、颠换及单碱基的插入或缺失所引起的[1]。【前人研究进展】1994年，SNPs这个术语首次在人类分子遗传杂志上出现，Lander正式提出SNPs为新一代分子标记[2]。1997年，作为第三代分子标记的SNPs的提出与应用，在生物界引起了DNA多态性研究的新高潮。在1999年的第二次“SNPs与复杂基因组”国际会议中，新增加了群体遗传学与信息学的领域[3]。随着SNPs的飞速发展，其在动植物中的研究开发也越来越受到关注，各种研究迅速开展，尤其是在重要农作物和模式动物中已经取得了可喜的成绩[4-6]。SNPs分子标记得到了较好的开发[7]，由于SNPs密度高，片段短，遗传稳定，易于高通量、自动化分析[8]，广泛用于绘制EST图谱、群体遗传学和连锁不平衡、遗传标记。而SNPs的检验方法有很多，测序和单链构象多态性(SSCP)检测技术已经非常的成熟，除此之外，有很多新的检测技术频频出现，并逐渐成为主要的检测手段。SNPs为基于测序的高密度遗传图谱的构建提供了有力工具[9]。直接测序法是目前最简单的SNPs检测方法，检出率基本可达到100 %。除此之外，采用直接测序的方法还能得到SNPs的类型以及准确位置等SNPs分型所需的重要参数。由于DNA测序趋于自动化以及测序成本的降低，使得直接测序法越来越多的应用于SNPs的检测和分型，出现了很多生物类型的全基因组分型SNPs芯片，然而这种芯片对大群体的试验来说，费用高，大部分实验室无法完成这类全基因组SNPs分型扫描。【本研究切入点】本试验利用候选基因直接测序比对后获得SNPs位点，并通过HRM筛选和验证SNPs，分析、总结直接测序结合HRM法进行SNPs位点的筛选和验证的优缺点，【拟解决的关键问题】以期为直接测序法进行大规模SNPs筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

玉米自交系H21，糯玉米紫糯96-619及171个以H21为轮回亲本、紫糯96-619为非轮回亲本回交5代自交2代的H21BC5F2∶3。材料由青岛农业大学分子育种实验室提供。

1.2 DNA的提取

取适量玉米种子播种于培养盆中，培养盆中沙土湿度适中，将培养盆放置28 ℃培养箱中进行暗培养，待玉米苗长至2～3片叶片时剪取叶片， CTAB法提取DNA，将其稀释到100 ng/μl，-80 ℃冰箱中冻存备用。

1.3 候选基因的测序

候选基因sbe1(AC211441)全长序列由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。根据候选基因AGPS1a-1(bt2)(AF334959)全长序列，利用Primer 5进行引物设计，共设计了8对分段引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体的引物设计情况如表1所示。

引物合成后进行PCR扩增，PCR反应体系(50 μl)为：dNTP 5 μl、5×buffer 10 μl、DNA模板 4 μl、上游引物 2 μl、下游引物 2 μl、高保真酶 1 μl、ddH2O 26 μl。PCR反应程序为：①95 ℃预变性1 min；②95 ℃变性20 s；③根据不同引物退火温度(50到55 ℃不等)，退火20 s；④72 ℃延伸30 s；⑤2～4重复35个循环；⑥72 ℃后延伸5 min。每一个PCR反应重复3次，产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序部进行测序。测序结果使用DNAMAN软件进行比对分析。再利用ContigExpress软件将核实后的测序结果进行基因片段序列的拼接，确定AGPS1a-1(bt2)的全长序列。

1.4 SNPs位点的查找

将获得的sbe1和bt2候选基因全长核酸序列用SoftBerry软件翻译成氨基酸序列，比对氨基酸序列的差异性。用Antheprot 5.0软件进行蛋白质二级结构预测；用SWISS MODEL网站进行蛋白质三级结构预测和功能域分析。根据亲本的基因序列及氨基酸序列比对结果，在SNPs位点设计引物，引物设计情况如表2所示。

1.5 SNPs位点在群体中的检测

利用表2中的引物对亲本进行普通PCR扩增之后，确定引物的最适退火温度。按照确定好的每对引物的最佳退火温度用于Rotor Gene Q(QIAGEN)的HRM(高分辨率熔解曲线) PCR扩增，通过与亲本间曲线的比对情况检测后代基因型的分型情况。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的提取

亲本及部分子代DNA提取结果如图1所示，提取的DNA的纯度和质量较好，没有RNA和其他杂质污染，条带较为清晰，可以进行后续的试验研究。

2.2 bt2目的片段的扩增

引物合成后进行目的片段PCR扩增，经0.8 %的琼脂糖凝胶电泳检测，部分结果如图2所示。

表1 bt2引物序列Table 1 Information of primers for bt2

表2 SNPs引物设计情况统计Table 2 Information of SNPs primers for bt2 and sbe1

2.3 bt2基因氨基酸序列比对与蛋白结构预测

从图3(封三)可以看出，bt2基因的氨基酸序列在第322处不同，H21在此处的氨基酸为甲硫氨酸，而紫糯96-619的为异亮氨酸。根据以上的氨基酸序列进行的蛋白质二级结构预测结果如图4所示。

从图4(封三)可以看出，bt2基因编码的蛋白质二级结构绝大多数都是α-螺旋和β-折叠，在亲本中的表现很相似，但是又存在不同(图4中箭头所示)，主要是折叠的位置不同或者区域大小有差别，如左侧箭头所示位置的β-折叠，H21比紫糯96-619明显小；如右侧箭头所示的位置H21比紫糯96-619明显少了一段β-折叠，说明bt2基因在亲本间的差异引起了蛋白二级结构的变化。

A：M.15000 DNA marker；1.紫糯96-619；2.H21；B：M.15 000 DNA marker；1～12：部分子代图1 亲本(A)及部分BC5 F2∶3(B)的DNA提取Fig.1 DNA extraction of parents(A)and some BC5F2∶3(B) individuals

M. 2000 bp DNA marker; 1. bt2-5 H21; 2. bt2-5 紫糯; 3. bt2-6 H21; 4. bt2-6 紫糯；5. bt2-2 H21; 6. bt2-2 H21; 7. bt2-2 紫糯; 8. bt2-2 紫糯; 9. bt2-7 H21; 10. bt2-7 H21; 11. bt2-7 紫糯; 12. bt2-7 紫糯图2 bt2部分引物对H21和紫糯96-619的扩增Fig.2 Partial results of H21 and ZN96-619 PCR amplification using primers of bt2

根据氨基酸序列的变化，在SWISS MODEL网站上应用同源建模法对蛋白质三级结构预测的结果如图5所示，bt2基因编码的两亲本之间的蛋白质空间结构的预测模型几乎是一样的，只在箭头所示的位置有所不同。说明bt2基因在亲本间的差异影响了蛋白三级结构。

本文利用AIS数据，构建船舶领域统计方法模型，并根据目标船周围最近船舶的相对位置分布情况，采用最小二乘法确定领域边界；利用荆州AIS数据对模型进行验证，并对比分析横驶船舶与直航船舶的船舶领域，得出横驶船舶领域与直航船舶领域形状特征的差异；对比不同尺度的上行和下行船舶的船舶领域，得到船舶尺度、航速对船舶领域大小的影响，为船舶在水上航行时的避碰和风险研究提供一定的理论依据。

2.4 sbe1基因氨基酸序列比对与蛋白结构预测

sbe1基因的氨基酸序列比对结果如图6所示，H21在第448个氨基酸为丙氨酸，紫糯96-619为天冬氨酸。根据以上的氨基酸序列进行的蛋白质二级结构预测结果如图7所示。

图7(封三)显示，sbe1基因编码的蛋白质二级结构绝大多数都是α-螺旋和β-折叠，折叠和无规则卷曲的位置及区域大小有差别，如箭头所示的位置H21与紫糯96-619一段β-折叠大小及位置明显不同，说明sbe1基因在亲本间的差异引起了蛋白二级结构的变化。

根据氨基酸序列的变化，在SWISS MODEL网站上应用同源建模法对蛋白质三级结构预测的结果如图8所示，sbe1基因编码的两亲本之间的蛋白质空间结构的预测模型几乎是一样的。

上述结果显示bt2和sbe1基因编码的各自的亲本蛋白质在空间结构上一样的，只是在螺旋的长度和折叠的数量上有细微的差别，其编码的蛋白质的具体功能有待进一步研究。

图8 sbe1基因编码的紫糯96-619和H21的蛋白质空间结构预测Fig.8 Spatial structure prediction of proteins encoded by gene sbe1 in ZN 96-619 and H21

2.5 bt2和sbe1基因中SNPs位点的筛选

根据sbe1和bt2候选基因全长核酸序列比对结果，在bt2基因找到17个SNPs位点，在sbe1基因找到3个SNPs位点(图略)，结合亲本氨基酸序列比对结果，共设计20对 SNPs引物，引物情况如表2所示。

从图9可以看出，纵轴显示的是荧光值，横轴表示的是温度，由于DNA双链中有SNPs存在，因此亲本之间在双链解开时候的温度有细微差异，以此将亲本间的SNPs检测出来。如图所示，引物bt2-5129对亲本紫糯96-619扩增出的DNA熔解峰值在76.7 ℃，对H21扩增出的DNA熔解峰值在77.2 ℃，有较为明显的峰值差别，在对171个子代进行分析的过程中，绝大多数后代的基因型与亲本紫糯96-619相同，只有5个与亲本H21相同。而部分引物如bt2-1918对亲本扩增的基因片段熔解最适温度差异过小(0.08 ℃)，无法进行基因分型。引物bt26271、引物bt26408扩增出的亲本基因片段熔解的最适温度差值分别为0.18、0.16 ℃，差异较小，也不宜用于后代基因分型。

如图10所示，引物sbe1-2240对亲本紫糯96-619扩增出的DNA熔解峰值在77.42 ℃，对H21扩增出的DNA熔解峰值在77.02 ℃，有较为明显的峰值差别，在对171个子代进行分析的过程中，绝大多数后代的基因型与亲本紫糯96-619相同，只有16个与亲本H21相同。

如图11所示，引物sbe1-2361对亲本紫糯96-619扩增出的DNA熔解峰值在78.33 ℃，对H21扩增出的DNA熔解峰值在78.85 ℃，有较为明显的峰值差别，在对171个子代进行分析的过程中，123个后代的基因型与亲本H21相同，只有48个与亲本紫糯96-619相同。

图9 引物bt2-5129对后代扩增的高分辨率熔解曲线和峰值Fig.9 HRM curves and peaks of some amplication results by primers bt2-5129

图10 引物sbe1-2240对后代扩增的高分辨率熔解曲线和峰值Fig.10 HRM curves and peaks of some amplication results by primers sbe1-2240

图11 引物sbe1-2361对后代扩增的高分辨率熔解曲线和峰值Fig.11 HRM curves and peaks of some amplication results by primers sbe1-2361

3 结 论

本文首先利用直接测序法获得bt2和sbe1基因的全长序列(基因登录号分别为KR337996、KR706462、KR706463和KR337995)，通过亲本间序列比对，找到了20个SNPs位点，通过高分辨率熔解曲线(HRM)，成功对171个高世代回交群体的SNPs位点分型。

4 讨 论

直接测序法是目前最简单的SNPs检测方法。其原理是：通过对不同个体的同一基因或者基因片段进行测序以及序列的比较，确定我们所研究的碱基是否变异，检出率可达到100 %。除此之外，采用直接测序的方法还能得到SNPs的类型以及准确位置等SNPs分型所需的重要参数。变性高效液相色谱(DHPLC)技术是在SSCP基础上发展起来的新技术[10]，这种方法的灵敏度和自动化程度很高，在未知SNPs位点的检测方面具有明显的优势，并且适合较大片段DNA的分析。其缺点是只能检测样本有无SNPs，不能确定SNPs的类型和位置，若想获得准确的SNPs类型与位置还是要通过测序的方法才能得到[11-12]。

目前检测SNPs的方法还有很多，如焦磷酸测序(pyrosequencing)，微测序(SNaPshot)、基于杂交原理的Taqman等。这些方法各有优势，但也存在如适宜位点数量少的样本，或者准确率低、费用较高等的缺点[13-14]。高分辨熔解曲线(High Resolution Melting, HRM)于2003 年由美国Wittwer 实验室第一次提出[15]。这种检测方法操作简便、快速，使用成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注，被 广泛用于特定突变位点SNPs(包括缺失、重复)的筛查、基因突变扫描、等位基因频率分析 、物种鉴定、品种鉴定 、甲基化研究 、动植物品质相关多态性位点的研究等[16-20]。

本文首先利用直接测序法获得bt2和sbe1基因的全长序列(基因登录号分别为KR337996、KR706462、KR706463和KR337995)，通过序列比对获得详细地SNPs位点信息，同时通过HRM技术快速、准确地对群体后代的基因分型。通过这2种方法的结合能高效完成大群体SNPs位点的筛选和分型。但在自主设计引物进行全基因扩增获得全序列的过程中，遇到了以下几个问题：一是参考基因序列显示某些区段GC含量较高，这会导致PCR扩增不出目的片段或所得的目的片段，目的条带不够亮，从而影响测序的结果；二是引物除扩增出特异性片段之外还有非特异性的片段，这对测序结果的准确性有一定的影响。因此，为了获得准确的测序结果，本实验中每个样品测序均进行了3次重复，以上所得结果是3次重复比对之后的结果，准确性较高。同时利用在通过HRM进行后代群体分型的过程中，部分引物如bt2-1918、bt2-6271、bt2-6408由于亲本基因片段熔解的最适温度差值较小，无法进行基因分型，需要通过重新测序或重新设计引物或可以解决，而有些位点受基因序列本身的影响很难设计出符合HRM分析的引物，因此，HRM技术还需要进一步完善与发展，使其更加有效地分析突变位点。

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