牛筋草对百草枯、草甘膦和草铵膦的抗药性水平测定

胡 芳，董慧荣，沈雪峰，刘 俊，魏吉平，陈 勇

(华南农业大学农学院，广东 广州 510642)

【研究意义】牛筋草(EleusineindicaL.)是禾本科单子叶植物，多生长于旱生作物田、果园或路边，生命力较强，表现出极大的竞争优势，已被列为世界十大恶性杂草之一[1-2]。杂草在田间的大量生长对作物生产造成极大损失[3]，由于过度依赖和长期使用相对单一的化学除草剂，已导致牛筋草对多种除草剂产生了抗药性，主要包括联吡啶类、有机磷类、膦酸类、二硝基苯胺类、环己烯酮类、二苯醚类、乙酰乳酸合成酶抑制剂类和乙酰辅酶A抑制剂类等[4-10]。【前人研究进展】百草枯和草甘膦是全球使用最广泛的灭生性除草剂[11-14]。百草枯的使用已有50多年的历史[15]，在其应用大约30年后的1980年，在台湾省发现第一例抗百草枯杂草-白酒草(Conyzasumatrensis)，其后抗百草枯杂草在许多国家均有报道[16]。2010年，在马来西亚的苦瓜农场发现百草枯对牛筋草的防效很不理想，进一步的研究发现其GR50是敏感性的3.60倍[2]。草甘膦具有独特的作用方式及代谢机制，在土壤中残留量极低，一度认为在田间不可能出现抗性杂草[17]。然而，1996年首先在澳大利亚发现了抗草甘膦的瑞士黑麦草(Loliumrigidum)对草甘膦的抗性提高了7.00 ～ 11.00倍[18]。2000年，在马来西亚发现了抗草甘膦的牛筋草种群[19]。随着草甘膦抗药性杂草的出现和百草枯水剂在国内被禁用，20世纪80年代开发的有机磷类灭生性除草剂—草铵膦具有吸收好、活性高、杀草谱广、低毒等特点逐渐被用于防除田间和果园杂草[13, 20-22]。然而，2010年，第一个抗草铵膦的牛筋草种群在马来西亚被发现[20]。调查发现在我国华南地区750 ～ 1500 g a.i./hm2剂量的草铵膦对柑橘园中禾本科杂草的防效在85 %以上[23]。2009年杨松等[24]在海南香蕉园发现20 %草铵膦在试验剂量下，对老龄牛筋草的防除不彻底，目测似干枯，但茎部以下未干枯，药后15 d未完全干枯的杂草开始有新叶抽出。杂草多抗性是指一种抗性杂草生物型同时对两种或两种以上作用机理完全不同的除草剂产生的抗药性[16]。2010年马来西亚发现对草铵膦和百草枯存在多抗性的牛筋草种群[2]。2015年，澳大利亚发现了对百草枯、草甘膦、草铵膦和乙酰辅酶A抑制剂类除草剂产生多抗性的牛筋草种群[22]。但是，杂草多抗性产生的机制还未见报道，已经存在的抗百草枯或者草甘膦的牛筋草能否加速对草铵膦产生抗药性，目前知之甚少。【本研究的切入点】本试验以广东省不同地区的牛筋草种子为材料，采用整株生物测定法法、培养皿法和莽草酸含量法，探索了采自不同用药历史地区的牛筋草种群对这3种除草剂的抗药性水平。【拟解决的关键问题】目前，在国内尚未见有关百草枯、草甘膦和草铵膦多抗性牛筋草种群的相关报道。本文旨在通过对广东省不同地区牛筋草抗药性的监测，筛选出对百草枯、草甘膦和草铵膦产生多抗性的种群，为延缓抗药性杂草的发展、科学合理治理抗药性杂草提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试验材料 13个牛筋草种群于2016年采集于广东省不同地区，种子采集信息和用药历史如表1所示。

1.1.2 供试仪器及药剂 3WP-2000型行走式喷雾塔(农业部南京农业机械化研究所制)；智能人工气候室(广州市深华生物技术有限公司)；电子天平(上海民桥有限公司)；低温台式离心机；UV-2550型紫外分光光度计(岛津仪器苏州有限公司)。

20 %的百草枯水剂(湖北仙隆化工股份有限公司)；30 %草甘膦异丙胺盐水剂(美国孟山都公司)；20 %的草铵膦水剂(浙江永农科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 牛筋草种群对百草枯的抗药性水平测定 采用温室盆栽法培养。将去壳的各种群牛筋草种子分别播种于盛有营养土和沙土(2∶1,v/v)的育苗盆中，待长到2 ～ 3叶期移入花盆(d=9 cm)中，每盆4株，置于32 ℃/25 ℃昼夜12 h交替光照，光强为800 μE·m-2·s-1，相对湿度为80 %的温室中培养，定期浇水。

待幼苗长至5 ～ 7叶期，采用行走式喷雾塔进行茎叶喷雾，测定不同种群牛筋草对百草枯的抗性水平。喷施剂量依次为0、75.00、150.00、300.00、600.00、1200.00 g a.i./hm2。以清水为对照，4次重复。喷药14 d后，称取地上部鲜重。

1.2.2 牛筋草种群对草甘膦的抗药性水平测定 采用培养皿监测法。将去壳的各种群牛筋草种子在200 mg·L-1浓度的赤霉素中浸泡20 min 以打破休眠。根据Cirujeda和Duran等方法[25-26]，将打破休眠后的种子均匀移入铺有两层滤纸并加入5 mL不同浓度草甘膦的培养皿中(d=9 cm)，草甘膦设置7个剂量浓度：0、61.50、123.00、153.75、184.50、215.25、246.00 g a.i./hm2，每个培养皿20粒种子。以清水为对照，4次重复。置于32 ℃/25 ℃昼夜12 h交替光照，光强为800 μE·m-2·s-1，相对湿度为80 %的温室中培养，定期给培养皿中加入等量的水以保持湿润。培养7 d后，每个培养皿中随机选取10株测定根长。

莽草酸含量法。该试验以培养皿法监测到的敏感型种群JM和两个抗性较强的种群QY01和CZ种群为材料。采用温室盆栽法待其生长至5 ～ 7叶期，选取生长一致的牛筋草，进行1.50倍田间推荐剂量草甘膦处理，分别在施药后1、2、3、5、7、9 d分别剪取抗性和敏感型牛筋草植株的地上部分茎叶测定莽草酸含量。

莽草酸含量测定方法[27]：取0.50 g茎叶组织，研钵中研磨成匀浆后加入1 mL 0.25 mol·L-1HCl，4 ℃离心(12 000 r/min, 15 min)，取上清液于5 mL离心管中，放置在冰上。4次重复。取200 μl上清液，加入2 mL 1 %过碘酸溶液，混匀，静置3 h后再加入1 mol·L-1的NaOH溶液2 mL，0.1 mol·L-1甘氨酸1.2 mL，混匀静置5 min，测定380 nm处的吸光值。根据莽草酸标准曲线计算出抗性和敏感型牛筋草植株地上部分茎叶中的莽草酸含量。

表1 牛筋草种子采集地点和用药史Table 1 The location and herbicide application background of Eleusine indica populations

莽草酸标准曲线制作[28]：将10 mg的莽草酸标准样品溶于1 mL 0.25 mol·L-1HCl中，分别取0、1.00、2.50、5.00、10.00、40.00、50.00、100.00 μl于试管中，加0.25 mol·L-1HCl至1 mL。与莽草酸含量测定的相同步骤测定OD值。

1.2.3 牛筋草种群对草铵膦的抗药性水平测定 采用温室盆栽法测定。待幼苗长至4 ～ 6叶期，采用行走式喷雾塔进行茎叶喷雾，测定不同种群牛筋草对草铵膦的抗药性水平。喷施剂量依次为0、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00、1600.00、3200.00 g a.i./hm2。以清水为对照，4次重复。喷药14 d后，称取地上部鲜重。

1.3 数据处理

使用Excel 2010和Originpro 9.0数据统计分析，根据牛筋草鲜重、根长和药剂用量拟合出毒力回归方程，求出抑制中剂量GR50值，并根据各种群GR50值得出抗药性倍数(IR)计算公式如下：

Y=aln[-bln(x)]

其中，Y代表抑制率，x代表药剂浓度;

敏感(IR<2)；低抗(210)[9]。

2 结果与分析

2.1 牛筋草种群对百草枯的抗药性监测

由表2可知，广东省不同地区的牛筋草种群对百草枯的抗药性水平存在明显的差异。其中，MZ04种群对百草枯抗药性水平最低，其GR50值仅为24.29 g a.i./hm2； QY05种群对百草枯的抗性水平最高，其GR50值为314.43 g a.i./hm2，是敏感型种群MZ04的12.94倍。该监测结果表明，采集的样品中大约61 %的牛筋草种群对百草枯处于中到高水平抗性，其种群分别为MZ02、QY01、ZQ02、PY06、NX、CZ、QY02、QY05，GR50值在146.16 ～ 314.43 g a.i./hm2。

2.2 牛筋草种群对草甘膦的抗药性监测

由表3可以看出，采用培养皿法监测结果表明，广东省不同地区的牛筋草种群对草甘膦的抗药性水平存在明显的差异。其中JM种群对草甘膦抗药性水平最低，其ED50值仅为25.29 g a.i./hm2；QY01牛筋草种群对草甘膦抗性水平最高，其ED50值为380.88 g a.i./hm2，是敏感型种群MZ04的15.12倍。该监测结果表明，采集的样品中54 %的牛筋草种群对草甘膦处于中到高水平抗性，其种群分别为QY4、QY05、NX、MZ02、PY06、CZ、QY01，ED50值在108.40 ～ 380.88 g a.i./hm2。

由图2可知，草甘膦处理后，植株体内莽草酸含量会随着喷施时间逐渐积累。而在JM种群植株体内莽草酸积累量要显著高于QY01和CZ种群。QY01和CZ种群植株体内的莽草酸只有轻微的积累，草甘膦处理9 d后，植株体内的莽草酸仅为32.62和52.23 μg·g-1。而种群JM植株体内的莽草酸含量迅速增加，草甘膦处理9 d后，植株体内莽草酸含量高达1934.36 μg·g-1。该结果表明，JM种群为敏感型牛筋草种群，而QY01和CZ为抗性型牛筋草种群。

表2 不同牛筋草种群对百草枯的抗药性Table 2 GR50 values and resistance levels of the Eleusine indica populations in relation to paraquat

表3 不同牛筋草种群对草甘膦的抗药性Table 3 ED50 values and resistance levels of the Eleusine indica populations in relation to glyphosate

图1 莽草酸标准曲线Fig.1 Shikimic acid standard curve

图2 草甘膦处理对牛筋草种群莽草酸含量的影响Fig.2 Effect of glyphosate on the content of shikimic acid in the Eleusine indica populations

表4 不同牛筋草种群对草铵膦的抗药性Table 4 GR50 values and resistance levels of the Eleusine indica populations in relation to glufosinate

2.3 牛筋草种群对草铵膦的抗药性监测

由表4可以看出，广东省不同地区的牛筋草种群对草铵膦的抗药性水平也存在明显的差异。其中NX种群对草铵膦抗药性水平最低，其GR50值仅为6.37 g a.i./hm2; CZ牛筋草种群对草铵膦的抗性水平最高，其GR50值为41.08 g a.i./hm2，是敏感型种群NX的6.45倍。结果表明，采集的样品中没有监测到高抗性种群，31 %的牛筋草种群对草铵膦处于中水平抗性，其种群分别为ZQ02、PY07、PY06、CZ，GR50值在30.65 ～ 41.08 g a.i./hm2。

2.4 筛选对百草枯、草甘膦和草铵膦产生多抗性的牛筋草种群

结合以上抗性监测结果可知，CZ、PY06、QY01、QY05、MZ02和NX种群存在对百草枯和草甘膦产生多抗性的可能；CZ和PY06种群存在对草甘膦和草铵膦产生多抗性的可能；CZ、PY06和ZQ02种群存在对百草枯和草铵膦产生多抗性的可能；因此，CZ和PY06种群对这3种除草剂存在多抗性的可能。其中MZ04、JM和NX分别为百草枯、草甘膦和草铵膦的敏感型牛筋草种群(图3～5)。

图3 抗性型和敏感型牛筋草种群的百草枯剂量Fig.3 The dose of resistance and sensitive Eleusine indica populations to paraquat

3 讨 论

近年来抗百草枯牛筋草已有大量报道，本试验中与百草枯敏感牛筋草种群相比，抗性牛筋草种群的相对抗性水平达到12.94倍，高于马来西亚抗性型牛筋草种群[2]，但与沈雪峰等几年前的监测结果(抗性生物型牛筋草的相对抗性水平达到59.48倍)相比，抗性下降很多[11]。这可能与生产中禁用百草枯有关[13]。本研究中与草甘膦敏感牛筋草种群相比，抗性牛筋草种群的相对抗性水平达到15.12倍，显著高于2000年马来西亚报道的8.00 ～ 12.00倍和2011年在美国发现的抗性倍数为12.00的牛筋草种群[19, 29]。然而，由于培养皿法简单，快捷可用于从大量种群中快速筛选出抗性和敏感型种群，但抗性等级可能存在一定误差[30]。草甘膦处理植物后，植株体内的莽草酸含量会大量积累[31]。而在敏感型植株体内莽草酸的积累量要显著高于抗性植株，莽草酸含量的多少可以证明杂草产生抗药性水平的高低[32-33]。结果表明，JM为草甘膦敏感牛筋草种群，QY01和CZ为草甘膦抗性牛筋草种群，说明培养皿法存在的误差较小，可以作为监测牛筋草对草甘膦的抗药性水平。

图4 抗性型和敏感型牛筋草种群的草甘膦剂量Fig.4 The dose of resistance and sensitive Eleusine indica populations to glyphosate

图5 抗性型和敏感型牛筋草的草铵膦剂量Fig.5 The dose of resistance and sensitive Eleusine indica populations to glufosinate

随着草甘膦抗药性杂草的出现和百草枯水剂在国内被禁用，草铵膦逐渐被用于防除田间和果园杂草，据广东省不同地区果农反映，草铵膦对牛筋草的防效却不理想，通过对采集的样品进行监测，与草铵膦敏感牛筋草种群相比，抗性牛筋草种群的相对抗性水平达到6.45倍，这与马来西亚和澳大利亚抗草铵膦生物型牛筋草研究的结果相似[21, 23]。这可能与百草枯在生产中被禁用，而草铵膦被用来填补市场空白有关[34]。本研究所采集的13个牛筋草种群中已有4个种群对草铵膦产生中等水平的抗药性，其中CZ、PY06和PY07均有草铵膦用药史，而ZQ02种群无草铵膦用药史，产生这种情况的原因可能与百草枯和草甘膦长期使用产生抗性后，导致植株表观特性(叶片表面蜡质层厚度和表面绒毛疏密)发生改变，减少除草剂的吸收有关，以至于对草铵膦也产生了抗药性。

结合牛筋草对百草枯、草甘膦和草铵膦的抗性监测结果可知，CZ和PY06种群对以上3种除草剂存在多抗性。这与2010年马来西亚和2015年余勤教授在澳大利亚发现的对百草枯、草甘膦、草铵膦产生多抗性的牛筋草种群研究结果相似[2, 22]。国内外对百草枯、草甘膦和草铵膦等除草剂开展了较为长期的监测及其抗性相关机理的研究，但尚未能系统阐明其抗性作用机制，在多抗性方面进展则更为缓慢。

4 结 论

本研究表明，采集的13个样品对这3种除草剂均存在不同程度的抗药性，其中CZ、PY06、QY01、QY05、MZ02和NX种群存在对百草枯和草甘膦产生多抗性的可能；CZ和PY06种群存在对草甘膦和草铵膦产生多抗性的可能；CZ、PY06和ZQ02种群存在对百草枯和草铵膦产生多抗性的可能；而CZ和PY06种群则存在对百草枯、草甘膦和草铵膦产生多抗性的可能。本研究结果为牛筋草的抗药性监测、牛筋草抗药性机制研究、延缓抗药性杂草发展和科学合理治理抗药性杂草提供理论依据。

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