静电纺丝素纳米纤维在生物医学组织工程领域的研究进展

唐培朵， 戴 俊， 杨晓东， 韦凌志

(1.广西科学院，广西 南宁 530007；2.广西科学院应用物理研究所，广西 南宁 530003)

引 言

天然材料中的丝素蛋白(SF)来源于蚕丝，由蚕丝经过脱胶制得，是一种天然高纯度蛋白质，由乙氨酸、丙氨酸、丝氨酸等20余种氨基酸组成，最终降解产物是氨基酸或寡肽，可被机体吸收。同时SF拥有良好的生物相容性、透氧性、生物可降解性以及植入体内的炎症反应微小等特点，在生物医学领域应用十分广泛。静电纺丝是制备超细纤维和纳米纤维的一种常用方法，以天然或者合成聚合物为原料，可以制备出直径从几十纳米至几微米的纤维[1-3]。利用静电纺丝技术制备的SF纳米纤维材料，保留了SF优良的生物相容性特性，并具有三维多孔结构，比表面积大且孔隙率高，能高度模仿了细胞外基质结构，促进组织再生，可广泛应用于组织工程、医药工程等许多领域[4-7]。

组织工程是将工程学和生命科学进行结合，利用生物材料制备病损组织模型，并经过在模型上种植细胞，达到模仿病损组织的形态，使其恢复为病损前的结构并具备该组织原有功能。经典的组织工程技术具备三个基本要素，即种子细胞、生物支架、生物因子。采用相关工艺技术制备成具有特定形状、结构和性能的组织工程支架，然后将一定数量的种子细胞接种到支架上，在生物因子的程序性刺激下，细胞按照预定的程序合成分泌相应的细胞外基质，并以生物支架为模板组装成特定的结构，同时生物支架逐渐降解为新生组织提供空间，从而最终修复受损组织和器官。近年来，采用静电纺技术制备的SF多孔纳米纤维支架材料，具有结构可控、成本低廉、比表面积大和易于表面功能化修饰的特点，已经广泛应用于骨、血管、神经、软骨、泌尿系统等组织和器官工程领域。

1 骨组织工程

骨组织工程材料作为人体支撑结构的替代物，需要有良好的力学性能。通常单一丝素蛋白作为电纺材料，由于其力学性能差，无法满足组织工程支架的使用要求，因此需对其进行交联或共混改性。朱海霖[8]等采用静电纺丝法制备了SF/硅酸钙(CS)复合纳米纤维。该复合纤维材料中SF的结构以SilkⅡ为主，亲水性比纯SF纤维要好，直径为200 nm～400 nm，孔隙率约78%。研究发现质量分数为20%的SF/CS复合纳米纤维在模拟体液中浸泡7 d后，表面覆盖了较厚的碳酸羟基磷灰石层，在Tris缓冲溶液中浸泡12周后的降解率达42.4%，这说明该复合纤维具有良好的生物活性和降解性，有望作为生物活性骨组织修复材料。浙江理工大学的王利君等[9]通过静电纺丝技术制备出聚乳酸-聚己内酯/丝素蛋白(PLA-PCL/SF)复合纳米纤维膜支架，经醇处理后，丝素蛋白相由无规自由态转变为β折叠结构。研究表明，随着复合纳米纤维膜中SF含量的增加，纤维膜的亲水性逐渐提高，有利于老鼠3T3类成骨细胞的黏附和增殖。同样，蔡江瑜等[10]通过静电纺丝技术制备了丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯[SF/P(LLA-CL)]纳米纤维支架，将支架与小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1复合培养，研究表明，SF/P(LLA-CL)纳米纤维支架具有较好的细胞相容性，能有效促进兔腱-骨愈合。

2 软骨组织工程

软骨是另一种类型的密集连接组织，由软骨细胞和不含血管、神经的细胞外基质构成。这在软骨修复的组织工程中，一个具有良好物理性能的三维支架很重要，要求细胞可以在支架提供的模拟细胞外基质的环境中生长，这种细胞/生物材料复合物在体外培养成熟后，移植到软骨组织病损部位，植入的细胞不断地增殖、分化，进而恢复受损软骨组织的生理功能。因此支架材料的生物安全性及相容性是研究的重点。张晓燕等[11]采用静电纺丝方法制备了丝素蛋白/左旋聚乳酸(SF/PLLA)复合纳米纤维材料，兔膝关节软骨细胞体外培养实验研究表明，SF/PLLA材料无毒，属于可以安全植入体内的生物材料。并将该支架材料埋入小鼠皮下，引起的组织反应与不可吸收缝线类似，引起的炎症反应较轻微，表现出良好的组织相容性；该材料与软骨细胞复合后，细胞与材料表现出良好的黏附性，具有良好的生物相容性。孙莹等[12]将兔膝关节软骨细胞与丝素蛋白/左旋聚乳酸(SF/PLLA)支架材料复合培养,在第3、7、14天分别作HE染色和阿利新蓝+核固红染色，扫描电镜检验细胞黏着情况，MTT试验检测细胞在支架上的增殖情况。结果显示，丝素蛋白/左旋聚乳酸(SF/PLLA)具有良好的细胞相容性，细胞在支架上可以获得良好的粘附，细胞增殖良好无细胞表型的变化，可作为软骨组织工程支架材料。李伟豪等[13]利用高压静电纺丝技术将丝素蛋白/聚己内酯(SF/PCL)溶液制备成三维支架式的纤维膜性结构。通过在SF/PCL三维支架膜上添加下颌骨髁状突软骨细胞(MCCs)培养液，观测SF/PCL三维支架膜上软骨细胞的生长情况探索其生物相容性及降解性能，结果显示，SF/PCL三维支架具有良好的生物相容性和可降解性，为进一步研究生物支架修复软骨组织损伤或缺损提供了实验依据。

3 血管组织工程

血管组织工程利用生物材料模拟损伤组织并重新种植或替换于原有组织上。最初研究者使用血管细胞结合天然基质分子组成组织工程血管，早期出现如人工血管内皮层容易脱落、抗凝效果欠佳及体外抗增耗时较长等问题，而组织工程血管选用更适合的材料，以期构建出抗凝效果好、生物相容性及安全性较好的材料，对临床修复受损血管有着重大意义。周伟[14]将丝素蛋白(SF)和乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解在HFIP中配制成溶液,采用静电纺丝技术制备了SF/PLGA纳米纤维支架,并考察了纤维支架表面对HUVECs细胞的相容性。结果表明:HUVECs可在SF/PLGA纤维支架表面很好的黏附和增殖，支架具有良好的细胞相容性，在血管组织工程领域有良好的应用前景。马力等[15]以壳聚精、SF等为天然骨架材料，经硫酸化修饰后，以静电纺技术缠绕、编织等制备了具有良好力学稳定性的壳聚糖-硫酸化丝素蛋白小口径人工血管，内径为3 mm，研究发现实验组血管形成了内皮细胞层、平滑肌层和成纤维细胞层 3层主要血管组织，在组织形态上与正常对照组血管无显著差别，说明壳聚糖-硫酸化丝素蛋白人工血管具有较好的生物相容性及功效性能。

4 神经组织工程

静电纺纳米纤维具有高的表面积体积比和孔隙率，其网络结构非常适合神经组织工程种子细胞的生长以及废物和营养物质的运输。苏州大学的董运海等[16]在再生SF纳米纤维网上种植星形胶质细胞，研究星形胶质细胞在其上的粘附、生长、增殖和迁移等生命活动。研究发现，该材料不仅支持星形胶质细胞的黏附与生长，而且还对细胞的迁移运动有引导作用，这些特点可以使得再生SF纳米纤维成为极具开发潜力的神经组织工程替代物。张鲁中等[17]采用静电纺丝技术制备SF/聚己内酯(PCL)纳米纤维支架。在体外，将雪旺细胞与支架及其浸提液共培养，并将纤维支架材料在体外置于蛋白酶ⅪⅤ溶液进行体外降解，研究发现，SF/PCL纳米纤维支架材料，呈现三维网状结构，支持雪旺细胞黏附与生长，无细胞毒性，具有良好的生物相容性和生物可降解性。同时也通过皮下埋植实验观察纤维材料在体内的局部组织反应。结果表明，皮下移植实验未引起明显免疫排斥反应，炎症反应轻。有望用于神经组织工程支架材料修复神经缺损。赵亚红等[18]则以石墨烯(Gr)和SF为原料，采用静电纺丝技术制备Gr-SF纳米纤维，并将雪旺细胞种植在该材料上，研究结果表明Gr-SF纳米膜具有合适的亲水性、导电性、孔隙率等理化特性，可支持共培养的雪旺细胞成活和增殖，具有良好的体外生物相容性，有望用于神经组织工程的制备。

目前，丝素蛋白已应用在神经系统修复方面，尤其在脊髓组织工程中也有一定的应用。由于脊髓组织的软组织特性，用于植入脊髓的支架材料常选用含水量高，且力学特性类似脊髓的材料，以丝素蛋白材料为构架的脊髓生物支架，已被证实可以修复或部分修复受损的脊髓神经功能。丝素蛋白材料能够支持骨髓间充质干细胞、表皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、嗅鞘细胞、血管内皮细胞等多种细胞的黏附、生长、发育、增殖、分化等。苏州大学的钱玉强等[19]将嗅鞘细胞接种到丝素蛋白纳米纤维上，实验结果表明，SF微纳米纤维网支持嗅鞘细胞的黏附、生长与增殖，生物相容性良好，有望成为修复或部分修复受损的脊髓神经功能的组织工程支架材料。本课题组也曾将SF纳米纤维导管 (内径1.5 mm)植入老鼠体内修复坐骨神经10 mm缺损，4个月后神经完全再生，功能得到部分恢复。这说明，SF微纳米纤维支架材料与神经类细胞有良好的生物相容性，支持细胞的黏附、生长与增殖，能够促进并引导缺损神经再生。

5 泌尿系统工程

魏盖杰等[20]将再生丝素膜、水溶性胶原蛋白粉末及聚己内酯按不同质量比共同溶于HFIP中，采用静电纺丝法制备了PCL/胶原/SF纳米纤维支架，并将体外培养的口腔黏膜上皮细胞接种至材料表面，研究表明，该支架材料具备合适的孔径和孔隙率，适合口腔黏膜上皮细胞生长，且细胞相容性良好，是一种组织工程尿道重建良好的支架载体。谢敏凯等[21]通过静电纺丝技术制备新型的经拉伸处理的SF材料，并将从实验组动物中获得、培养、扩增其尿路上皮细胞，种植于该材料上，培养1周，获得组织工程移植物，体外实验表明，经拉伸处理的静电纺SF材料为三维多孔结构，尿路上皮细胞在该材料上生长良好，可在材料表层多层生长，且细胞能渗透入材料内部。在动物体内实验中，实验组动物未表现排尿困难，尿道造影示尿道未见明显狭窄,组织学检测显示术后1个月1层～2层上皮细胞覆盖修复部位，上皮细胞逐渐生长，无炎症反应，在术后6个月形成典型的尿路上皮细胞结构。因此可以得出，经拉伸处理后的静电纺SF材料有良好的生物相容性，可成为潜在的尿道重建材料。蒋丹等[22]以丝素蛋白(RSF)/膀胱脱细胞基质(BAM)/透明质酸(HA)水溶液为纺丝液,通过静电纺丝法制备RSF/BAM/HA复合纤维支架。利用BAM 中的内源性生长因子，以期提高RSF/BAM/HA复合纤维支架的生物活性；考察了猪髋血管内皮细胞(PIECs)细胞在支架材料上的生长和粘附情况。结果表明，这些生物活性因子使RSF/BAM/HA复合纤维支架比纯RSF支架更有利于细胞的粘附与增殖。RSF/BAM/HA复合纤维支架良好的生物相容性、生物活性以及生物降解性使其在泌尿系统组织修复中具有广阔的应用前景。

6 结束语

在制备纳米纤维材料的所有工艺方法中，静电纺丝被认为是最简单也是最有效的方法。由于纳米纤维材料模拟了组织中天然细胞外基质结构，近年来通过静电纺丝将SF加工成三维纳米纤维支架材料成为了研究热点。尽管SF纳米纤维在生物医学组织工程领域的应用研究上已经取得一定成果，但临床应用仍面临许多问题，大部分还处在实验阶段。目前，丝素蛋白主要被静电纺丝加工成微纳米纤维网、导管和三维材料(柱状体等)，这些材料的形态、结构、力学性能、生物学性能已经得到了广泛的研究。随着生物技术的日新月异，静电纺丝技术的不断进步和发展，SF纳米纤维在生物医学领域将会展现出更广阔的应用前景。