磁性载mNGF纳米微粒的制备及外磁场引导下修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究

李立军　海米提·阿布都艾尼　宗强　王帅　王亮　倪东馗

1天津医科大学第二医院骨科（天津 300211）；2滨州医学院烟台附属医院创伤骨科（山东滨州 264100）

周围神经损伤的治疗到目前为止仍然是困扰医学界的难题，局部应用外源性神经生长因子（NGF）治疗周围神经损伤取得了一定的临床效果［1-2］，目前多采用局部注射、局部浸润等方法，但是应用外源性的NGF存在局部药物无法浓集、过早失活、穿透血神经屏障［3］困难的缺点。本研究通过制备磁性纳米载药微粒，装载外源性NGF，在外磁场的引导下应用于坐骨神经损伤大鼠，利用磁性纳米微粒的跨膜特性、磁场下趋向性，探索这一新方法治疗周围神经损伤的有效性。

1　材料与方法

1.1实验动物、主要试剂及仪器健康SD大鼠，60只，雌雄不限，体质量（280± 10）g，购自天津市奥臣实验动物销售有限公司。鼠神经生长因子（mNGF，未名生物工程生物医药有限公司），聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA，德国赢创集团），磁性氧化铁颗粒，小鼠神经生长因子ELISA试剂盒（天津福瑞祥科技有限公司），尼高力Viking Quest肌电诱发电位仪，1.0T磁场。

1.2磁性纳米载NGF粒子的制备、表征采用单乳化溶剂蒸发法（O/W），取200 mg PLGA室温下溶于500 μL二氯甲烷（有机相），加入16 mL铁磁性铁颗粒，形成褐色溶液（试管1）。取18 μg的mNGF放在500 μL的水中（水相），用搅拌器搅拌1 min（试管2），在细胞粉碎机里将试管1溶液缓慢加到试管2里，并加入到5 mL 0.5%CHA溶液里，凝固纳米粒子的表面，然后用旋转蒸发器除去二氯甲烷，离心30 min（离心转速9 000 r/min），制备的样品在4℃下冷冻干燥24 h，制成纳米粒子冻干粉。激光粒度分析仪测量粒子粒径。用酶标仪绘制产品标准曲线，测定包封率（EE，%），测定载药量（DL，%），由ELISA法计算磁性纳米mNGF粒子释放量，测定释药率。

1.3大鼠坐骨神经模型制备及分组10%水合氯醛腹腔麻醉（0.30 mL/100 g），大鼠右侧卧位固定于手术台，常规备皮、消毒左下肢，无菌条件下取左大腿后上部切口，显露坐骨神经，于梨状肌下缘1 cm横行锐性切断坐骨神经，在神经断端的近、远端，环形剥离神经外膜并切除1.0 mm长的神经束，吻合口神经外膜行间断外翻缝合，使神经断端留有2.0 mm的小间隙。

60只大鼠分3组：A、B组每周尾静脉注射1次磁性纳米NGF微粒悬浮液，A组左下肢外磁场引导2 h，B组不施加外磁场；C组每周仅尾静脉注射同含量的NGF溶液。

1.4术后8周坐骨神经指数（SFI）测定大鼠双后爪涂上碳素墨水，置于自制的大鼠足印行走箱中，得到相应足印。测其双后跟到第3趾尖的距离（PL）、第一趾到第五趾的距离（TS）以及第二趾到第四趾的距离（ITS），根据公式计算SFI［4］。

1.5术后8周神经电生理检查大鼠麻醉后，沿原左下肢切口切开，暴露左坐骨神经，将记录电极刺入腓肠肌肌腹，接地电极置于大鼠尾部皮肤表面，依次将刺激电极置于夹伤处近、远侧坐骨神经干，刺激神经，记录复合肌动作电位（compound muscle action potentials，CMAPs）。测量CMAPs的传导速度。

1.6小腿三头肌湿重比测量、坐骨神经组织学观察处死大鼠，切取双侧小腿三头肌，测重，计算伤肢与健肢小腿三头肌湿重比。完整切取左侧坐骨神经，沿神经纵轴切片，HE染色。

1.7统计学方法使用SPSS 13.0统计软件，实验结果以表示，各组间比较分别采用Kruskai Wallis检验、单因素方差分析、卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1磁性纳米粒子表征磁性纳米粒子粒径分布在198～210 nm里，平均粒径为205.9 nm，大小均匀，粒径集中，具有良好的分散性。封包率为69.43%，载药量为3.11%。生长因子在溶液中是持续释放，108 h内释放率为92%。

2.2SFI测定术后8周A组SFI值为（-34.91±7.86）；B组SFI值为（-56.97± 10.29）；C组SFI值为（-61.68±9.56），A组分别与B组和C组比较差异有统计学意义（P＜0.05），B组与C组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1　术后2个月坐骨神经指数测定Tab.1　SFI in two months after surgery ±s

表1　术后2个月坐骨神经指数测定Tab.1　SFI in two months after surgery ±s

注：a，Kruskai Wallis检验，两两比较，A组与B组P=0.000，A组与C组P=0.000，B组与C组P=0.12

因素A组B组C组均值-34.91±7.86-56.97±10.29-61.68±9.56 χ2值36.62 P值0.000a

2.3神经电生理检测术后8周，A组大鼠左坐骨神经的神经传导速度（31.00±3.30）m/s＞B组（21.30±4.79）m/s和C组（23.15±4.53）m/s。A组分别与B组和C组比较差异有统计学意义（P＜0.05），B组与C组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2　术后2个月CMAPs传导速度测定Tab.2　Nerve conduction velocity two months after surgery±s，m/s

表2　术后2个月CMAPs传导速度测定Tab.2　Nerve conduction velocity two months after surgery±s，m/s

注：b，单因素方差分析，两两比较，A组与B组P=0.000，A组与C组P=0.000，B组与C组P=0.236

因素A组B组C组均值31.0±5.3 23.2±4.5 21.3±4.8 χ2值22.22 P值0.000b

2.4小腿三头肌湿重比测定术后8周伤侧小腿三头肌均发生不同程度的萎缩，A组肌肉湿重比值为0.51±0.09），B组为0.41±0.06，C组为0.39±0.06。A组分别与B组和C组比较差异有统计学意义（P＜0.05），B组与C组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3　术后2个月小腿三头肌湿重比测定Tab.3　Quality ratio of triceps surae two months after surgery

2.5坐骨神经组织学观察坐骨神经沿神经长轴切片HE染色，B、C两组可以看到神经原吻合处再生神经纤维排列紊乱、神经纤维密度较低，A组再生的神经纤维通过吻合处，排列较整齐，神经纤维密度高于其他两组。见图1。

3　讨论

图1　药物制备、实验及组织HE染色图Fig.1　Drug preparation experimental and tissue HE staining

本研究所制备磁性纳米粒子，采用PLGA为包覆材料，包裹Fe3O4和mNGF，采用单乳化溶剂蒸发法制备壳核式结构的纳米微粒［6］，平均粒径较小，粒径均匀，性质稳定。所用PLGA由2种单体——乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料［7-8］。PLGA为外壳的纳米微粒具有良好的缓释作用，起到保护装载药物，避免体内过早失活的作用，因而可以实现局部的持续缓慢释药，保证持续的药物浓度。此外，PLGA本身具有良好的生物相容性，有一定的跨生物膜屏障作用［9］，因而有助于外源性NGF跨过血-神经屏障，到达神经轴突再生处，增加微环境中的NGF浓度，从而促进再生轴突的生长［10］。

实验动物组每周1次尾静脉注射磁性纳米NGF微粒，通过1.0 T外界磁场引导，术后8周测得的CAMP及SFI结果均好于其他两组。磁性纳米粒子在外磁场下具有良好的聚集性，相比未施加外部磁场的实验组，虽经尾静脉注射相同剂量的纳米粒子悬浮液，但施加外部磁场的实验动物坐骨神经损伤周围纳米粒子的浓度更高。经过外磁场一定时间的吸引，磁性微球的大量聚集使血流减慢，从而提高了颗粒的滞留，可能使更多的载体血管外渗出发生。这样，微球起到了血管外药物贮存站的作用。通过磁场的引导作用，可以实现靶向控制释药，增加局部的药物浓度，从而改善周围神经损伤微环境中的NGF浓度，促进神经再生。也有国外学者制备微泵向神经断端缓慢释放的方法提高NGF的疗效［11］，但体内埋入的微泵易导致感染且操作相对较复杂，在临床难以应用。

目前，PLGA已广泛应用于制药工程，载药制备技术成熟，PLGA与mNGF结合，有助于进一步提高药物治疗的效果，便于将来进一步向临床推广。应用外部磁场引导磁性纳米载NGF微粒实现磁靶向给药，实际上是借鉴其他疾病的靶向治疗方法［12］。采用磁靶向治疗的方法来传递外源性NGF，磁场既可以准确引导药物的聚集，同时适宜的磁场环境也有助于神经恢复［13］。本实验开创性的将磁靶向结合纳米载药技术应用到周围神经损伤的治疗，为周围神经损伤的治疗提供了一个新思路，但真正要应用到周围神经损伤的临床治疗，路还很漫长。

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