长链非编码RNA在胃癌发生发展中的作用

蒋 葵

(大连医科大学附属第二医院 肿瘤科，辽宁 大连 116027)

胃癌是全世界范围内常见的恶性肿瘤之一，我国胃癌的发病率和死亡率均高居第二位[1]，胃癌患者的总体预后较差，临床缺乏有效的生物标记物。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200 nt非编码RNA[2]，一度被认为是基因转录的噪音，但近年来的研究显示其作为重要的基因表达调控元件，在表观遗传学、转录及转录后水平等环节发挥调控作用，对细胞增殖、凋亡、血管生成、促进转移等方面具有重要影响[3]。越来越多的研究显示，lncRNA可能成为肿瘤诊断及预后的生物标记物。

1 LncRNA的分类及功能

根据lncRNA与所在位置相邻基因的关系，lncRNA常分为7类[3]：(1)反向lncRNA(divergent lncRNA，pancRNA)：它与互补编码蛋白的基因具有相同的启动子，但是与转录方向相反；(2)同向lncRNA(convergent lncRNA)：其转录方向与互补链编码蛋白的基因转录方向相对；(3)基因间lncRNA(intergenic lncRNA,lincRNA)：位于距其他基因较远的位置，长度常大于10 kb，如果来源于具有高H3K4me3/H3K4me1比值的启动子转录产物，称plncRNA；(4)重叠lncRNA(overlapping lncRNA)：与其他基因重叠，在同一条链或者互补链上；(5)单向-双向增强子RNA(unidtrectinal-bidirectional enhancer RNAs)，来源于增强子转录产物称eRNAs，具有双向转录，而来自低H3K4me3/H3K4me1比值的启动子单向转录称elncRNA；(6)内含子lncRNA(intronic lncRNA)：来自另一基因内含子转录产物；(7)miRNA宿主基因(miRNA host gene)。

目前大量研究显示，lncRNA的作用主要集中于以下方面[4]：(1)激活基因；(2)抑制基因表达；(3)促进染色体修饰；(4)介导染色体重塑；(5)调节mRNA剪接；(6)miRNA海绵；(7)调节翻译，降解；(8)改变蛋白质定位，调节蛋白质活性，蛋白质复合物的结构之一；(9)产生小RNA前体。

2 LncRNA与胃癌

近年来运用RNA-seq等技术对胃癌组织标本和胃癌细胞做了大量研究，发现许多lncRNA对胃癌的生物学行为有着重要作用，对胃癌的诊治有重要的临床意义。

2.1 H19

H19是位于染色体11p15.5上H19/IGF2基因印迹簇的转录产物，拥有35个开放阅读框却没有对应的蛋白，故被认为是lncRNA。

H19可促进细胞增殖。在胃癌组织和多个胃癌细胞系中显著上调[5]，Yang等[6]发现在AGS细胞系中上调H19后细胞增殖增加，沉默H19后可诱导凋亡。其生物学功能可通过H19/miR-65轴进行调节：在胃癌细胞系中H19可通过miR-675靶向调节RUNX1(runt domain transcription factor 1)基因调节胃癌细胞的生长[7]。在MKN45细胞系敲除H19/miR-675和SGC7901过表达H19/miR-675模型中，发现H19通过结合ISM1使其上调，通过miR-675间接抑制CALN1(calneuron 1)，从而促进肿瘤的侵袭和转移[8]。此外在胃癌中H19除靶向调节RUNX1和CALN1，H19/miR675轴通过RUNX1还可以激活Akt/mTOR通路[9]。

H19与胃癌患者预后及早期诊断有关。Zhang等[10]研究显示胃癌患者中H19高表达与生存期短相关，是总生存的独立预后因子，可能与c-Myc诱导有关。有研究通过ROC分析胃癌患者外周血中H19发现，患者术后外周血中的H19明显下降，提示H19可作为胃癌诊断和早期胃癌筛选的潜在指标[11]。

在中国胃癌患者中，与H19相关的SNP检测提示CT+TT rs217727和CT+TT rs2839698者胃癌风险明显增加，提示H19还与胃癌易感性可能有关[12]。

2.2 HOTAIR(HOX antisense intergenic RNA)

HOTAIR是由Rinn等[13-14]于2007年发现长度为2158nt受HOX基因控制的lncRNA，HOTAIR不受HOXC基因簇影响，但是可作用于HOXD基因簇一段40 kb区域。

HOTAIR增高水平与胃癌临床病理特征有关。其在胃癌组织和胃癌细胞中较癌旁组织表达明显升高，与TNM分期，脉管癌栓，淋巴结转移相关，是预后不佳的指标[15]。Endo等[15]根据HOTAIR在胃癌组织中的表达水平分为高表达组(HOTAIR/GAP-DH>1)和低表达组(HOTAIR/GAPDH<1)，高表达组较低表达组静脉受侵高，淋巴结转移高，生存率低，进一步对KATO-III胃癌细胞进行HOTAIR siRNAs转染，发现克隆形成减少，将过表达HOTAIR的MKN74和低表达HOTAIR的KATO-III细胞分别注入裸鼠体内，发现对应的肝转移增加而腹膜转移减少。Liu等[16]还发现HOTAIR作为ceRNA下调miR-331-3p，从而解除HER2抑制，转录后水平明显升高，HOTAIR/HER2阳性表达与进展期胃癌相关。

HOTAIR还与胃癌细胞侵袭、凋亡及转移能力有关。应用siRNA技术将AGS细胞HOTAIR下调，发现肿瘤侵袭能力降低，与侵袭有关的MMP1、MMP3降低，间质指标vimentin和N-cadherin下降，而诱发上皮性指标E-cadherin增加。沉默HOTAIR可调节Snail和EMT相关转录因子使上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)减少[17]。Lee等[18]发现在MKN28、MKN74和KATO-III细胞中沉默HOTAIR后可以诱导凋亡，降低癌细胞增殖。HOTAIR高表达的BGC-823细胞经shRNA沉默HOTAIR后，发现PCBP1(Poly r(C)-binding protein)下调幅度最大，提示HOTAIR可能通过结合PCBP1从而促进胃癌生长和转移[19]。

此外，Pan等[20]研究了SNP对HOTAIR表达/功能和胃癌风险的影响，通过分析中国800例胃癌患者和1600例对照患者基因，筛选出易感性SNP rs920778，rs920778 TT 携带者比CC携带者患胃癌风险高1.66-1.87倍，在胃癌细胞和组织中也发现T等位基因携带者的HOTAIR表达水平更高，而Du等[21]在中国人中发现，HOTAIR另一SNP rs4759314与胃癌风险增加有关，其AG基因型HOTAIR表达较AA型更高，可作为预测胃癌的指标。

HOTAIR还与胃癌化疗耐药有关，Yan等[22]发现HOTAIR在顺铂耐药的胃癌细胞中高表达。可能机制是其作为ceRNA抑制miR-126表达，促进VEGFA和PIK3R2表达，激活PI3K/AKT/MRP1，从而促使胃癌顺铂耐药，这一机制提示HOTAIR可作为治疗靶点之一以克服胃癌铂耐药。

2.3 CCAT1(colon cancer-associated transcript-1)

CCAT1是近年新发现的lncRNA，被发现在结肠癌中上调。CCAT1位于8q24.21，长度2628 nt，含有3个ORFs但不能翻译成蛋白质。

CCAT1在多种肿瘤组织中高表达，与肿瘤发生发展有关，提示其具有癌基因功能。有研究通过检测19例胃癌患者的CCAT1水平，发现胃癌组织中CCAT1表达比对照组高10.8倍，复发性胃癌表达最高，同时也检测到AGS细胞中CCAT1高表达，提示CCAT1可作为胃癌早期诊断及随访的指标[23]。

CCAT1可以促进胃癌细胞增殖及迁移，而相关的作用机制探索甚少。在胃癌及多种肿瘤中发现cMyc能够直接与CCAT1启动子的E-box结合[24]；另一机制与miR490/ hnRNPA1zhou轴有关，CCAT1在胃癌细胞中可以调节miR490，两者呈负相关，推测CCAT1具有miR490结合位点，而抑制miR490可解除沉默CCAT1导致的胃癌细胞迁移受抑制，miR490可与hnRNPA1 mRNA 3’-UTR结合，两者之间存在负相关，CCAT1表达与hnRNPA1表达正相关，说明通过CCAT1/miR490/hnRNPA1轴可以促进胃癌细胞的迁移[25]。

2.4 MALAT-1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1)

MALAT-1最初在肺癌被发现，是位于11q13、长度8700nt的lncRNA，可预测早期非小细胞肺癌转移和生存。

研究显示MALAT1在细胞增殖、迁移和转移有重要作用，在转录水平上对多种基因有调节作用[26]。MALAT1在多种胃癌细胞系中呈高表达，可促进癌细胞增殖，作用机制多种多样。MALAT1可诱导核内SF2/ASF过表达，敲除MALAT1可使SF2/ASF(pre-mRNA-splicing factor 2/alternative splicing factor，即serine/arginine splicing factors)表达明显下降，而SF2/ASF过表达却不会影响细胞增殖，提示MALAT1对胃癌增殖的机制一部分是通过调节SF2/ASF实现[27]。通过RIP-seq技术发现MALAT1可以与EZH2(enhancer of zeste homolog 2，polycomb repressive complex 2催化亚基)结合，抑制肿瘤抑制因子PCDH10，从而促进胃癌细胞的迁移、侵袭和转移[28]。沉默MALAT1后，MALAT1对胃癌的侵袭和迁移作用均减弱，而同时沉默EGFL7(epidermal growth factor-like domain-containing protein 7)后，上述作用可被反转，进一步行ChIP检测显示MALAT1调节EGFL3表达是通过改变EGFL7启动子的H3组蛋白乙酰化水平实现的[29]。

MALAT1除了在胃癌组织和细胞中高表达，还在转移性胃癌的组织及外周血中高表达，与预后差相关。MALAT1与miRNA互相作用是调节胃癌生物学的常见机制，胃癌细胞中MALAT1的异常与miR-122/IGF-1R(insulin-like growth factor 1 receptor)通路有关，其中miR-122与MALAT1负相关，而IGF-1R则正相关[30]，除了miR-122，参与调节的其他通路包括miR-202/Gli2(一种锌指蛋白)、miR-1297/HMGB2(high-mobility group protein B2)[31-32]。沉默MALAT1可降低snail、N-cadherin以及升高E-cadherin，这些Wnt/β-catenin通路的改变，提示MALAT1可能参与EMT的调节[33]。MALAT1还参与VE-cadherin/β-catenin复合物、ERK/MMP和FAK/paxillin等信号通路调节血管生成拟态(VM)和血管生成从而促进胃癌发生和发展[34]。

2.5 GAPLINC(gastric adenocarcinoma predictive long intergenic noncoding)

GAPLINC于2014年首次报道，通过分析胃癌和对照组lncRNA微芯片结果，发现uc002kmd.1上调最明显，根据预测分析，命名为GAPLINC。GAPLINC与胃癌患者预后差有关系，可促使胃癌细胞增殖、侵袭。机制一是由于其“分子海绵”的功能，可以竞争性结合miR-211-3p形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，由于miR-211-3p可靶向降解CD44，故miR-211-3p减少导致CD44表达上调[35]。另一机制与缺氧有关，GAPLINC在常氧状态下即可促进细胞生存及抑制细胞死亡，同时伴有HIF-1α上调。在缺氧条件下，GAPLINC表达上调，促进癌细胞增殖更加明显，而敲除GAPLINC后，缺氧下的改变比常氧更加明显。沉默GAPLINC后通过miR-211下调Bcl-2、上调Bax、Bcl-2/Bax比值下降等凋亡相关指标，在缺氧下消除HIF-1α或者HIF-2α后GAPLINC可被下调(常氧下无明显改变)，其中HIF-1α作用更明显，HIF-1α可以与GAPLINC启动子区域结合，从而GAPLINC通过缺氧途径调节胃癌细胞的增殖[36]。

2.6 HULC(highly upregulated in liver cancer)

HULC最初于2007年在肝细胞癌中发现有特异性上调，长约1600 nt，包含2个外显子，可作为miR372的分子海绵，调节转录后的基因表达。在胃癌组织及胃癌细胞系中，HULC促进胃癌细胞增殖、侵袭的机制可能与EMT和凋亡有关，HULC过表达后LC3-II/LC3-I比值升高(microtubule-associated protein 1 light chain 3)，说明其通过激活自噬抑制凋亡，而HULC被沉默后E-cadherin上调、vimentin下调，EMT相关指标出现变化，提示HULC参与调节EMT[37]。

胃癌患者外周血中可检测到稳定的循环HULC，高表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分期以及幽门螺杆菌感染有关，诊断的AUC高达0.888，高于CEA和CA72-4诊断价值，高表达HULC组生存期较短，说明HULC可作为胃癌诊断及预后的指标之一[38]。

2.7 PVT1(plasmacytoma variant translocation 1)

PVT1最初发现于1984年，位于8q24，长度超过300 kb，在8号染色体上PVT1基因座产生的嵌合转录产物，可能通过距离上游57 kb的MYC介导其癌基因效应[39]，PVT1在多种肿瘤中有癌基因作用，其机制与PVT1-p53-MYC等基因网络可能有关，近年发现在胃癌中有重要作用。

PVT1在胃癌组织中高表达与化疗耐药显著相关，通过分析 lncRNA芯片数据，发现PVT1在紫杉醇耐药的SGC7901中比SGC7901更高，提示PVT1可能与胃癌紫杉醇耐药有关[40]。与顺铂未耐药的胃癌组织和细胞相比，PVT1在耐药的胃癌组织和细胞中均较高表达，进而导致MDR1、MRP、mTOR和HIF-1α表达增加，提示PVT1可以促进胃癌多药耐药，也是潜在逆转耐药的靶点[41]。

PVT1发挥癌基因功能还与FOXM1(forkhead box protein M1)相关，PVT1可以直接与FOXM1蛋白结合并增加其转录后表达，同时FOXM1也能直接与PVT1启动子结合并激活其转录，形成正反馈环路，最终导致胃癌细胞的增殖和侵袭[41]。

对80例胃癌患者进行多因素分析后，发现PVT1还是总生存的独立预后因子，进一步行RIP证实PVT1与EZH2相关，PVT可使胃癌细胞停滞于G1/S，而沉默PVT后p15和p16表达增加，提示PVT可能通过抑制p15、p16作用于细胞周期[42]。

2.8 ANRIL(CDKN2B antisense RNA 1)

ANRIL是INK4B-ARF-INK4A基因座重叠的长链非编码反义RNA，转录产物可以促进/维持CDKN2B(INK4b)基因的表观遗传状态，是INK4b的反义转录物，其长度约3.8 kb，可与PRC2结合发挥生物学作用，对癌细胞增殖，侵袭及迁移有重要作用，在不同肿瘤中有抑癌基因或者癌基因作用，目前在胃癌中认为发挥癌基因作用。

通过检测120例胃癌患者的ANRIL表达，发现ANRIL高表达与TNM和肿瘤大小有关，是生存期的独立预后因子。ANRIL促进胃癌细胞增殖，机制可能是ANRIL结合PRC2抑制miR-99a/miR-449a，从而调节mTOR和CDK6/E2F1路径，相互间形成正反馈循环[43]。ANRIL的启动子区域可被TET2(ten-eleven translocation)结合，调节胃癌细胞的增殖克隆[44]。

ANRIL还与胃癌化疗多药耐药相关，在分别对顺铂和氟尿嘧啶耐药的胃癌患者与胃癌细胞中，ANRIL均高表达，当沉默ANRIL后，发现耐药细胞分别恢复了对顺铂和氟尿嘧啶的敏感性，进一步检测发现MDR1和MRP1在mRNA及蛋白水平均下调，提示ANRIL可通过MDR1和MRP1增加胃癌细胞的耐药性，提示ANRIL是潜在逆转胃癌耐药的靶点之一[45]。

2.9 TINCR(terminal differentiation-inducing non-protein coding RNA，PLAC2)

TINCR位于染色体19号，产生3.7 kbp转录物，与上皮分化有关。TINCR与STAU1(staufen1)相结合后，可介导分化相关mRNA(如KRT80)的稳定性，因而在体细胞组织分化中有重要的作用[46]。在胃癌中，TINCR表达被核转录因子SP1诱导，沉默TINCR后可抑制细胞的增殖，克隆，促进凋亡等，进一步发现TINCR可以结合STAU1蛋白，影响KLF2 mRNA表达，进而调节CDKN1A/P21和CDKN2B/P15转录，最终影响胃癌细胞的增殖和凋亡[47]。在中国汉族602例胃癌患者中分析TINCR的SNP rs8113645 GA/AA和rs2288947 AG/GG和胃癌发病风险降低相关[48]。

2.10 GAS5(growth arrest-specific transcript)

GAS5长度约650bp，含有12个外显子，在乳腺癌和头颈部肿瘤等多种肿瘤中表达缺失，提示具有抑癌基因的功能。分析89例胃癌组织和5种胃癌细胞系，发现GAS5均明显下调，而较低的GAS5表达水平与较差的DFS和OS有关，过表达GAS5可抑制胃癌细胞生长和增殖，诱导凋亡，相反抑制GAS5则可促使胃癌细胞增殖，这种抑癌基因作用可能部分地通过调节E2F1和P21实现[49]。GAS5下调后可导致YBX1(Y-box binding protein 1)以及p21表达下降，解除G1停滞，提示GAS5可以通过YBX1/p21通路抑制胃癌细胞的增殖[50]。

2.11 MEG3(maternally expressed gene 3)

MEG3是位于14q32.3上DLK1-MEG3基因座地印迹基因，含有10个外显子，长度1600nt，在许多类型肿瘤组织和癌细胞系中缺失表达，是具有抑癌基因作用的lncRNA，明显增加p53表达。MEG主要通过与miRNA相互作用，调节胃癌细胞生物学行为。

MEG3表达在胃癌组织较癌旁组织显著下降，MEG3表达水平与TNM分期，浸润深度，肿瘤大小相关，MEG表达水平越低，预后越差，敲除MEG3后可促进胃癌细胞的增殖，抑制凋亡，下调p53表达[51]。MEG在胃癌细胞中可被miR148a，miR-141抑制而下调，其中涉及的机制可能分别是miR148a调节其靶基因DNA甲基化转移酶1和miR-141下调E2F2表达，最终MEG受到抑制，促进胃癌增殖[52-53]。MEG可作为竞争性內源RNA(ceRNA)结合miR-181，进而调节miR-181靶基因Bcl-2，从而影响细胞凋亡，最终调节胃癌细胞的增殖，迁移，侵袭和凋亡[54]。MEG作为miR-770的宿主基因，两者在胃癌组织和细胞系表达下调，它们的表达水平与TNM分期及淋巴结转移相关，过表达的MEG和miR-770抑制胃癌细胞的增殖和侵袭，推测两者可能发挥抑癌基因的作用，进一步研究表明近端启动子和增强子的过甲基化可能是导致两者失活的关键机制[55]。

2.12 ZFAS1(zinc finger antisense 1)

ZFAS1是近年新发现的lncRNA，可调节齿龈发展和乳腺上皮细胞分化。目前在胃癌中研究较少。ZFAS1在胃癌组织和细胞中均高表达，ZFAS1敲除后可胃癌细胞增殖抑制，诱导凋亡，抑制EMT，ZFAS1可被外泌体运输增强胃癌细胞的增殖和迁移[56]。ZFAS1在胃癌患者的循环肿瘤细胞中发现与EMT有关，ZFAS1还通过与EZH2和LSD1/CoREST作用，抑制KLF2和NKD2的转录，促进胃癌细胞增殖[57-58]。

3 小结与展望

近年来，lncRNA在胃癌中的研究与日俱增，对了解胃癌的分子生物学越来越重要。本文回顾了近年来重要的、与胃癌相关的lncRNA，发现lncRNA对胃癌细胞机制的影响非常复杂，包括lncRNA作为“分子海绵”与miRNA互相作用，直接或间接调节靶基因，与蛋白质结合形成复合物，表现内源竞争性RNA特征，介导凋亡和EMT，参与胃癌的多药耐药等，但目前很多lncRNA在胃癌中的作用机制仍不明确，亟待深入研究。另外，大量的研究表明lncRNA在胃癌组织异常表达，与胃癌患者的诊断和预后明显有关，可作为胃癌诊断和预后的潜在有效指标，有着重要的临床意义。随着lncRNA信息学在胃癌上的逐步完善丰富，今后对胃癌的诊治将会产生重大影响，可能改写目前胃癌的诊治模式，甚至指导胃癌的诊疗。