小檗碱对胰岛素抵抗模型小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α/骨骼肌葡萄糖转运蛋白4表达的影响

万仕炜, 郁　梅, 张　珂, 韩诗雨, 尚宜志, 方彭华, 张真稳

(1. 江苏省泰州市南京中医药大学翰林学院 基础医学实验中心, 江苏 泰州, 225300; 2. 江苏省苏北人民医院 内分泌与代谢科, 江苏 扬州, 225001; 3. 南京中医药大学附属泰州市中医院, 江苏 泰州, 225300)

2型糖尿病发病机制是多种因素综合导致的后果，以胰岛素受体或受体后缺陷引起的胰岛素抵抗为主要病理特征。胰岛素抵抗能够导致骨骼肌、脂肪等组织摄取与利用葡萄糖减少，引起高血糖。骨骼肌葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)表达减少是产生胰岛素抵抗的重要原因[1]。探寻能够促进骨骼肌GLUT4表达的方法已成为降低机体胰岛素抵抗的重要研究方向。

江苏省六大人才高峰课题(WSN-113); 江苏省泰州市科技支撑(社会发展)项目(TS201723)

小檗碱主要从中药黄连提炼出来的一种异喹啉生物碱，其作用非常广泛[2]。在体和离体研究结果[3-4]表明，小檗碱具有改善胰岛素抵抗、降低血糖、纠正脂质紊乱的作用，然而其确切机制尚不清楚。为进一步探讨小檗碱改善胰岛素抵抗的机制，本实验通过胰岛素抵抗模型小鼠探索其对骨骼肌细胞GLUT4蛋白表达的影响及其机制，现报告如下。

1　材料与方法

1.1　药物和试剂

小檗碱(Berberine)购于Sigma公司。Trizol、cDNA逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购于北京天根生化科技有限公司。

1.2　动物模型

扬州大学比较医学实验中心购买60只3周龄健康C57/BL6雄性小鼠。小鼠依据体质量随机分配在装有木屑的聚丙烯鼠笼中，饲养条件: 温度(21±2)℃，相对湿度(50±15)%, 12 h昼夜循环，自由进食(高脂饮食或标准饲料)。标准饲料由60%碳水化合物，21%蛋白质和19%脂肪所组成。高脂饮食组成包括约20%碳水化合物，21%蛋白质和59%脂肪。喂养8周后，用快速血糖仪测定所有小鼠空腹血糖。继续喂食2周，每周测量1次血糖，连续2次测量血糖水平都超过7.8 mmol/L的小鼠即为胰岛素抵抗模型小鼠。然后分为3组: 小檗碱用药组(n=8)每日灌胃小檗碱50 mg/kg, 肥胖对照组(n=8)和正常对照组(n=8)每日灌胃生理盐水，连续给药2周。给药结束，测小鼠12 h空腹血糖并进行糖耐量试验，收集血液和骨骼肌组织标本。血液用3 500 转/min离心10 min来提取血浆。所有标本置于-80℃冷冻待测。

1.3　胰岛素敏感性检测

测完空腹血糖12 h后腹腔注射葡萄糖(1.5 g/kg溶于无菌水中, 10 mL/kg), 然后分别在0、15、30、60、90和120 min的时候检测小鼠尾静脉中血糖水平。

1.4　胰岛素检测

通过ELISA法检测血浆胰岛素。根据说明书, 3次重复检测，并且选取测量的平均值。

1.5　Real-time PCR检测GLUT4和PGC-1α

1 mg骨骼肌Trizol提取总RNA。采用分光光度法在260/280 nm波长下计算RNA浓度，而RNA的完整性是通过运行样本在TAE缓冲液(40 mmol/L三乙酸，1 mmol/L EDTA)中的1%琼脂糖凝胶的状况来观察。之后将1 μg RNA逆转录为20 μL cDNA, 通过实时定量PCR荧光检测测定GLUT4 mRNA和PGC-1α表达水平。以下是寡核苷酸引物: GLUT4 forward 5′-ACAGGGCAAGGATGGTAGA-3′, reverse 5′-TGGAGGGGAACAAGAAAGT-3; PGC-1α Forward 5′-ACCATGACTACTGTCAGTCACTC-3′, Reverse 5′-GTCACAGGAGGCATCTTTGAAG-3′; GAPDH Forward 5′- AGAACATCATCCCTGCATCC -3′, Reverse 5′- TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3′。总反应体系20 μL, 扩增条件: 95 ℃10 min下开始最初变性; 95 ℃15 s, 62 ℃ 60 s, 循环40次。反应结束后收集分析扩增曲线及溶解曲线，采用2-ΔCt×100%对Real-time PCR的结果进行相对定量统计。

1.6　数据分析

通过单因素方差分析对多组间平均值进行比较，并取得平均值±标准差。以P<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。

2　结　果

2.1　小鼠血糖及胰岛素变化

从图1可以看出，与正常对照组相比，肥胖对照组小鼠空腹血糖水平显著升高(P<0.01), 胰岛素水平显著升高(P<0.05)。与肥胖对照组相比，小檗碱组小鼠空腹血糖水平显著降低(P<0.01), 胰岛素水平略升高(P>0.05)。

2.2　小鼠葡萄糖耐量试验(IGTT)和AUC指数

从图2可以看出，与正常对照组相比，肥胖对照组小鼠0、15、30、60、90、120 min血糖水平均显著升高(P<0.01), AUC胰岛素抵抗指数显著增加(P<0.01)。与肥胖对照组相比，小檗碱组小鼠0、15、30、60、90、120 min血糖水平均显著降低(P<0.01), AUC胰岛素抵抗指数显著降低(P<0.05)。

**P<0.01 vs. OC; #P<0.05 vs. NC; ##P<0.01 vs. NC.

**P<0.01 vs. OC; ##P<0.01 vs. NC.

图2各组小鼠IGTT和AUC变化水平

2.3　小鼠骨骼肌细胞GLUT4mRNA和

PGC-1αmRNA表达水平

从图3可以看出，与正常对照组相比，肥胖对照组小鼠GLUT4mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。与肥胖对照组相比，小檗碱组小鼠GLUT4mRNA表达水平显著增加(P<0.01)。

从图4可以看出，与正常对照组相比，肥胖对照组小鼠PGC-1α mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。与肥胖对照组相比，小檗碱组小鼠PGC-1α mRNA表达水平显著增加(P<0.01)。

**P<0.01 vs. OC; ##P<0.01 vs. NC.

*P<0.05 vs. OC; ##P<0.01 vs. NC.

图4各组小鼠骨骼肌PGC-1α基因表达水平

3　讨　论

2型糖尿病是常见的慢性非传染性疾病。目前，中国糖尿病患者人数和增长率均居世界第一，其中95%以上都是2型糖尿病。2型糖尿病发病机制复杂，主要由于胰岛素抵抗引起[5]。近年来越来越多的研究[6-8]表明小檗碱对2型糖尿病动物模型具有改善胰岛素抵抗、降低血糖、纠正脂质紊乱的作用。本研究显示，与肥胖对照组相比，小檗碱灌胃后小鼠血糖显著下降，表明小檗碱能够降低胰岛素抵抗小鼠的血糖效应，然而小檗碱灌胃后小鼠胰岛素水平略升高，表明小檗碱对糖尿病小鼠的胰岛素分泌无显著性的影响。与肥胖对照组相比，小檗碱灌胃后小鼠葡萄糖清除能力明显升高，胰岛素抵抗指数明显下降，表明小檗碱能够增加胰岛素敏感性，降低胰岛素抵抗。

GLUT4的表达减少是导致胰岛素抵抗的重要因素之一[1, 9]。骨骼肌细胞膜上GLUT4的数量和活性，决定了机体对葡萄糖的摄取和胰岛素敏感性。本研究显示，肥对照组小鼠骨骼肌细胞GLUT4 mRNA水平明显低于健康对照组小鼠。与糖尿病对照组相比，小檗碱灌胃后小鼠骨骼肌细胞GLUT4 mRNA水平显著升高，表明小檗碱能够促进胰岛素抵抗小鼠的骨骼肌细胞GLUT4 mRNA表达水平，提高胰岛素敏感性。

PGC-1α能够提高外周组织对糖、脂氧化代谢，改善胰岛素抵抗。大鼠骨骼肌PGC-1α过表达能够增加骨骼肌细胞GLUT4表达水平，逆转2型糖尿病或肥胖[10]。本研究发现，小檗碱能够显著增加骨骼肌PGC-1α表达。PGC-1α可能是介导小檗碱提高GLUT4表达，增加胰岛素敏感性重要机制之一。

[1] Leto D, Saltiel A R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4[J]. Nature Reviews Molecular Cell biology, 2012, 13(6): 383-396.

[2] Cicero A F G, Tartagni E. Antidiabetic properties of berberine: from cellular pharmacology to clinical effects[J]. Hospital Practice, 2012, 40(2): 56-63.

[3] Shan CY, Yang JH, Kong Y, et al. Alteration of the intestinal barrier and GLP2 secretion in Berberine-treated type 2 diabetic rats[J]. J Endocrinol, 2013, 218(3): 255-262.

[4] Gu JJ, Gao FY, Zhao TY. A preliminary investigation of the mechanisms underlying the effect of berberine in preventing high-fat diet-induced insulin resistance in rats[J]. J Physiol Pharmacol, 2012, 63(5): 505-513.

[5] IDF Diabetes Atlas. Global estimates of diabetes prevalence for 2015 and projections for 2040[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2015, 98: 524-525.

[6] Yang J, Yin J, Gao H, Xu L, Wang Y, Xu L, Li M. Berberine improves insulin sensitivity by inhibiting fat store and adjusting adipokines profile in human preadipocytes and metabolic syndrome patients[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2012, 2012: 363845-363853.

[7] 陈 广, 陆付耳, 王增四, 等. 小檗碱改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗与PI3K、GLUT4蛋白相关性的研究[J]. 中国药理学通报, 2008, 24(8): 1007-1013.

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[9] Bose A, Guilherme A, Robida S I, et al. Glucose transporter recycling in response to insulin is facilitated by myosin Myo1c[J]. Nature, 2002, 420(6917): 821-824.

[10]Bostrm P, Wu J, Jedrychowski MP, et al. A PGC-1α-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis[J]. Nature, 2012, 481: 463-468.